劉哲言，屈武斌，張成崗

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，全軍軍事認(rèn)知與心理衛(wèi)生研究中心，北京100850)

近年來，以核酸分子雜交為基礎(chǔ)的生物技術(shù)如聚合酶鏈反應(yīng)、DNA印跡、RNA印跡、芯片雜交等在病原微生物檢測、臨床診斷中應(yīng)用廣泛，其可靠性依賴于寡核苷酸分子與其靶點(diǎn)結(jié)合的高穩(wěn)定性與特異性，而分析這種結(jié)合特性的關(guān)鍵在于寡核苷酸與靶分子結(jié)合的二級結(jié)構(gòu)的精確預(yù)測，否則會導(dǎo)致假陰性或假陽性的檢測結(jié)果［1－4］。

已有研究顯示最近鄰模型(Nearest-Neighbor Model，簡稱NN model)是預(yù)測寡核苷酸二級結(jié)構(gòu)最可靠的熱力學(xué)計算方法［5］，該模型指出一個給定堿基對的穩(wěn)定性依賴于其臨近堿基對的穩(wěn)定性。其基本思想是將核酸分子結(jié)合過程中的標(biāo)準(zhǔn)焓變和熵變計算轉(zhuǎn)化為由A、T、G、C所形成的10個完美匹配二聚體以及非完美匹配結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)焓變和熵變的累加和，再加上起始和結(jié)束單獨(dú)匹配堿基對GC或AT以及序列對稱性等因素的影響［6－7］。然而，由于寡核苷酸單分子自身折疊或者雙分子雜交所形成的二級結(jié)構(gòu)具有多樣性與復(fù)雜性，除完美匹配外，還包含單獨(dú)錯配、連續(xù)錯配、內(nèi)環(huán)、膨脹環(huán)、末端搖擺、CNG重復(fù)、GU擺動等多種模式。因此，寡核苷酸二級結(jié)構(gòu)熱力學(xué)計算的精確性還需要依賴上述多種結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)參數(shù)。

鑒于目前的熱力學(xué)數(shù)據(jù)分散于不同的文獻(xiàn)中［8－11］，且不同來源數(shù)據(jù)可靠性不一，因此本文根據(jù)學(xué)術(shù)界對不同來源數(shù)據(jù)的認(rèn)可程度，系統(tǒng)性的綜述了近年來廣泛用于寡核苷酸二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的熱力學(xué)參數(shù)及相關(guān)計算，并指出當(dāng)前數(shù)據(jù)庫的局限及未來發(fā)展方向，從而為相關(guān)人員進(jìn)行研究提供整合數(shù)據(jù)庫資源，促進(jìn)寡核苷酸二級結(jié)構(gòu)的精確預(yù)測。

1 DNA與DNA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

1.1 完美匹配

針對DNA/DNA相互作用雙鏈中Watson-Crick的 AT、GC配對，SantaLucia于 1998年提出的在1mol/L NaCl環(huán)境下的寡核苷酸最近鄰熱力學(xué)參數(shù)是與實(shí)驗數(shù)據(jù)誤差最小的參數(shù)表［8］，受到廣泛應(yīng)用(見表1)。其中ΔH、ΔS與ΔG分別表示標(biāo)準(zhǔn)焓變、標(biāo)準(zhǔn)熵變和標(biāo)準(zhǔn)自由能，可直接從熱力學(xué)參數(shù)表獲取。完美匹配結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)計算如下:

表1 DNA/DNA結(jié)合完美匹配最近鄰熱力學(xué)參數(shù)(1 mol/L，37℃)Table 1 Nearest-neighbor thermodynamic parameters for DNA/DNA perfect matches(1 mol/L，37℃)

1.2 單獨(dú)錯配

當(dāng)出現(xiàn)單獨(dú)錯配的模式時，應(yīng)用 Allawi、SantaLucia以及Peyret等人于1997～1999年提供的熱力學(xué)數(shù)據(jù)［9－13］(見表2)。單獨(dú)錯配結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)計算如下:

表2 單獨(dú)錯配結(jié)構(gòu)熱力學(xué)參數(shù)(1 mol/L，37℃)Table 2 Thermodynamic parameters for DNA/DNA single mismatch(1 mol/L，37 ℃)

1.3 連續(xù)錯配

當(dāng)出現(xiàn)連續(xù)錯配即兩個毗連錯配的模式時，應(yīng)用Allawi、SantaLucia以及Peyret等人于1997～1999年提供的熱力學(xué)數(shù)據(jù)［9－13］(見表3)。連續(xù)錯配結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)計算如下:

表3 連續(xù)錯配結(jié)構(gòu)熱力學(xué)參數(shù)(1 mol/L，37℃)Table 3 Thermodynamic parameters for DNA/DNA tandem mismatches(1 mol/L，37 ℃)

1.4 內(nèi)環(huán)

當(dāng)出現(xiàn)內(nèi)環(huán)即三個及其以上毗連錯配的模式時，應(yīng)用Santalucia和Hicks于2004年提供的熱力學(xué)數(shù)據(jù)［14］(見表4)。內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)計算如下:

表4 內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)熱力學(xué)參數(shù)(1 mol/L，37℃)Table 4 Thermodynamic parameters for DNA/DNA internal loop(1 mol/L，37 ℃)

1.5 單獨(dú)搖擺末端

所謂單獨(dú)搖擺末端(Single dangling-end)，指雜交序列5’或3’末端出現(xiàn)一個未匹配的核酸即空位gap結(jié)構(gòu)(用“－”表示)。當(dāng)出現(xiàn)這種模式時，應(yīng)用Bommarito等人于2000年提供的熱力學(xué)數(shù)據(jù)［15］(見表5)。Single dangling-end結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)計算如下:

表5 Single dangling-end結(jié)構(gòu)熱力學(xué)參數(shù)(1 mol/L，37℃)Table 5 Thermodynamic parameters for DNA/DNA single dangling-end(1 mol/L，37 ℃)

1.6 長搖擺末端

所謂長搖擺末端(Long dangling-end)，指雜交序列5’或3’末端出現(xiàn)連續(xù)兩個及其以上未匹配的核酸即空位gap結(jié)構(gòu)(用“－”表示)。當(dāng)出現(xiàn)這種模式時，應(yīng)用Sugimoto等人于2002年提供的熱力學(xué)數(shù)據(jù)［16］(見表6)。Long dangling-end結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)計算如下:

表6 Long dangling-end結(jié)構(gòu)熱力學(xué)參數(shù)(1 mol/L，37℃)Table 6 Thermodynamic parameters for DNA/DNA long dangling-end(1 mol/L，37 ℃)

1.7 單獨(dú)膨脹環(huán)

所謂單獨(dú)膨脹環(huán)(Single bulge loop)，指雜交序列內(nèi)部出現(xiàn)一個未匹配的核酸即空位gap結(jié)構(gòu)(用“－”表示)。當(dāng)出現(xiàn)這種模式時，應(yīng)用Tanaka等人于2004年提供的熱力學(xué)數(shù)據(jù)［17］(見表7)。Single bulge loop結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)計算如下:

表7 Single bulge loop結(jié)構(gòu)熱力學(xué)參數(shù)(1 mol/L，37℃)Table 7 Thermodynamic parameters for DNA/DNA single bulge loop(1 mol/L，37 ℃)

1.8 長膨脹環(huán)

所謂長膨脹環(huán)(Long bulge loop)，指雜交序列內(nèi)部出現(xiàn)連續(xù)兩個及其以上未匹配的核酸即空位gap結(jié)構(gòu)(用“－”表示)。當(dāng)出現(xiàn)這種模式時，應(yīng)用Santalucia和Hicks于2004年提供的熱力學(xué)數(shù)據(jù)［14］(見表8)。Long bulge loop結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)計算如下:

表8 Long bulge loop結(jié)構(gòu)熱力學(xué)參數(shù)(1 mol/L，37℃)Table 8 Thermodynamic parameters for DNA/DNA long bulge loop(1 mol/L，37 ℃)

2 DNA與RNA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

當(dāng)DNA與RNA相互作用時，完美匹配的最近鄰熱力學(xué)參數(shù)表由Sugimoto等人于1995年提出［18］(見表9)，完美匹配結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)計算同1.1。

表9 DNA/RNA結(jié)合完美匹配最近鄰熱力學(xué)參數(shù)(1 mol/L，37℃)Table 9 Thermodynamic parameters for DNA/RNA perfect matches(1 mol/L，37 ℃)

3 RNA與RNA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

3.1 完美匹配

當(dāng)RNA與RNA相互作用時，完美匹配的最近鄰熱力學(xué)參數(shù)表［19］由Xia等人于1998年提出(見表10)。當(dāng)mRNA與RNA相互作用時，完美匹配的最近鄰熱力學(xué)參數(shù)表［20］由Turner等人于2006年提出(見表11)。完美匹配結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)計算同1.1。

表10 RNA/RNA結(jié)合完美匹配最近鄰熱力學(xué)參數(shù)表(1 mol/L，37℃)Table 10 Thermodynamic parameters for RNA/RNA perfect matches(1 mol/L，37 ℃)

表11 mRNA/RNA結(jié)合完美匹配最近鄰熱力學(xué)參數(shù)表(1 mol/L，37℃)Table 11 Thermodynamic parameters for mRNA/RNA perfect matches(1 mol/L，37 ℃)

3.2 錯配

當(dāng)出現(xiàn)單獨(dú)錯配的模式時，應(yīng)用Znosko等人于2008年提供的熱力學(xué)數(shù)據(jù)［21］(見表12)，其中R表示嘌呤堿基，Y表示嘧啶堿基;單獨(dú)錯配結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)計算如下:

當(dāng)出現(xiàn)連續(xù)錯配的模式時，應(yīng)用Turner等人于1999和2006年提供的熱力學(xué)數(shù)據(jù)［22－23］(見表13)。連續(xù)錯配結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)計算如下:

表12 單獨(dú)錯配結(jié)構(gòu)熱力學(xué)參數(shù)(1 mol/L，37℃)Table 12 Thermodynamic parameters for RNA/RNA single mismatch(1 mol/L，37 ℃)

表13 連續(xù)錯配結(jié)構(gòu)熱力學(xué)參數(shù)表(1 mol/L，37℃)Table 13 Thermodynamic parameters for RNA/RNA tandem mismatches(1 mol/L，37 ℃)

3.3 內(nèi)環(huán)

當(dāng)出現(xiàn)內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)，應(yīng)用Turner等人于1999年和2006年提供的熱力學(xué)數(shù)據(jù)［22－23］(見表14)。內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)計算如下:

3.4 CNG 重復(fù)序列

所謂CNG重復(fù)序列，是指一條序列(5’至3’方向)由多個G(CNG)xC的子片段組成的序列，這里x是指CNG重復(fù)的數(shù)目;N代表一種單獨(dú)錯配類型即N/N。當(dāng)出現(xiàn)這種模式時，應(yīng)用Broda等人于2005年提供的熱力學(xué)數(shù)據(jù)［24］(見表15)。CNG重復(fù)結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)計算如下:

表14 內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)熱力學(xué)參數(shù)(1 mol/L，37℃)Table 14 Thermodynamic parameters for RNA/RNA internal loop(1 mol/L，37 ℃)

表15 CNG重復(fù)結(jié)構(gòu)熱力學(xué)參數(shù)(1 mol/L，37℃)Table 15 Thermodynamic parameters for CNG repeats(1 mol/L，37 ℃)

3.5 GU擺動配對

當(dāng)RNA/RNA相互作用呈現(xiàn)多個連續(xù)的GU配對(非Watson-Crick配對)結(jié)構(gòu)時，應(yīng)用Turner等人于1999年提供的熱力學(xué)數(shù)據(jù)［22］(見表16)。GU擺動配對結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)計算如下:

表16 GU擺動配對結(jié)構(gòu)熱力學(xué)參數(shù)(1 mol/L，37℃)Table 16 Thermodynamic parameters for GU wobble base pairs(1 mol/L，37 ℃)

3.6 搖擺

對于Sigle dangling-end模式，應(yīng)用Serra等人于2006和2008年提供的熱力學(xué)數(shù)據(jù)［25－26］(見表17);對于Long dangling-end模式，應(yīng)用Sugimoto與Serra等人于2002和2006年提供的熱力學(xué)數(shù)據(jù)［16，25］(見表18)，其中 R表示嘌呤堿基，Y表示嘧啶堿基。Dangling-end結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)計算同1.5與1.6。

表17 Single dangling-end結(jié)構(gòu)熱力學(xué)參數(shù)(1 mol/L，37℃)Table 17 Thermodynamic parameters forRNA/RNA single dangling-end(1 mol/L，37℃)

表18 Long dangling-end結(jié)構(gòu)熱力學(xué)參數(shù)(1 mol/L，37℃)Table 18 Thermodynamic parameters forRNA/RNA long dangling-end(1 mol/L，37 ℃)

3.7 膨脹環(huán)

對于Single bulge loop模式，應(yīng)用Serra等人于2007年提供的熱力學(xué)數(shù)據(jù)［27］(見表 19)，Single bulge loop結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)計算同1.7;對于Long bulge loop結(jié)構(gòu)應(yīng)用Turner等人于1999和2006年提供的熱力學(xué)數(shù)據(jù)［22－23］(見表 20)，Long bulge loop 結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)計算如下:

表19 Single bulge-end結(jié)構(gòu)熱力學(xué)參數(shù)(1 mol/L，37℃)Table 19 Thermodynamic parameters for RNA/RNA single bulge-end(1 mol/L，37 ℃)

表20 Long bulge-end結(jié)構(gòu)熱力學(xué)參數(shù)(1 mol/L，37℃)Table 20 Thermodynamic parameters forRNA/RNA long bulge-end(1 mol/L，37 ℃)

4 特殊堿基的熱力學(xué)參數(shù)

除上述ATCGU之外，生物體中同樣存在一些非正常的堿基如肌苷(Inosine base，I)、羥基腺嘌呤(2_hydroxyadenine pairs，A*)等。目前發(fā)現(xiàn)肌苷在RNA/RNA相互作用中以IU匹配的形式出現(xiàn)，相關(guān)的熱力學(xué)數(shù)據(jù)由Znosko等人于2007年提供［28］(見表21);肌苷在DNA/DNA相互作用中的熱力學(xué)數(shù)據(jù)由 Santalucia等人于2005年提供(見表22)［29］，熱力學(xué)計算如下:

羥基腺嘌呤(A*)的熱力學(xué)參數(shù)由Sugimoto等人于2001年提供［30］，通常 A*只在5’－GA*C －3’以及5’－TA*A－3’序列中出現(xiàn)(見表23)。熱力學(xué)計算如下:

表21 RNA/RNA結(jié)合含有I堿基的熱力學(xué)參數(shù)(1 mol/L，37℃)Table 21 Thermodynamic parameters for RNA/RNA inosine base(1 mol/L，37 ℃)

表22 DNA/DNA結(jié)合含有I堿基的熱力學(xué)參數(shù)(1 mol/L，37℃)Table 22 Thermodynamic parameters for DNA/DNA inosine base(1 mol/L，37 ℃)

表23 DNA/DNA結(jié)合含有A*結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)參數(shù)(1 mol/L，37℃)Table 23 Thermodynamic parameters for DNA/DNA A*(1 mol/L，37 ℃)

5 結(jié)語與展望

寡核苷酸二級結(jié)構(gòu)的精確預(yù)測在分子生物學(xué)應(yīng)用中發(fā)揮越來越重要的作用，熱力學(xué)參數(shù)的不斷完善使其精確性得到逐步提高。本文針對不同二級結(jié)構(gòu)，綜述目前可利用的有效熱力學(xué)數(shù)據(jù)庫，涵蓋完美匹配、錯配、內(nèi)環(huán)、膨脹環(huán)、末端搖擺、CNG重復(fù)、GU擺動配對以及包含肌苷和羥基腺嘌呤等結(jié)構(gòu)?；诒疚牡臄?shù)據(jù)，用戶可以根據(jù)不同需求選擇合適的數(shù)據(jù)集，開發(fā)自有或者改進(jìn)現(xiàn)有的寡核苷酸二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測算法，從而提高以寡核苷酸雜交為基礎(chǔ)的分子生物技術(shù)的成功率。

然而，生物學(xué)過程是復(fù)雜的，許多基于核酸雜交的生物技術(shù)實(shí)驗中包含的酶，環(huán)境的pH值，Ca2+、Mg2+等離子以及一些變性劑如甲酰胺(formamide)、DMSO(二甲基亞砜)都會顯著影響寡核苷酸二級結(jié)構(gòu)的評估［14］;并且，除 A、T、C、G、U 正常堿基以及少數(shù)報道的特殊堿基外，其他生物分子如經(jīng)甲基化或者乙?；揎椇蟮暮塑账嵋泊罅看嬖谟谏矬w中。因此，未來有必要通過實(shí)驗補(bǔ)充新的熱力學(xué)參數(shù)，使現(xiàn)有的熱力學(xué)數(shù)據(jù)得到充實(shí)和完善，以進(jìn)一步提高熱力學(xué)計算的精確性，從而促進(jìn)寡核苷酸二級結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確預(yù)測。

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