盧 英，豐繼華，單秋甫，陳攀峰，單增輝

(云南民族大學(xué)電氣信息工程學(xué)院，云南昆明650500)

采用模式生物進(jìn)行研究的理論基礎(chǔ)源自于物種間基本生命過程的保守性，即從一個生物得到的知識可能外推到包括人在內(nèi)的另外一個生物上。例如單細(xì)胞生物可以用來研究基本的細(xì)胞生化過程，避免了研究多細(xì)胞生物體內(nèi)組織和器官分化所帶來的復(fù)雜性。但是，采用同樣的方式卻不能用單細(xì)胞生物的代謝來解釋控制多細(xì)胞生物所需要的每一個過程。每種生物都具有其獨特性。因此，對過度外推模式生物得到的結(jié)論必須保持謹(jǐn)慎。具體選擇哪種模式生物更好，需要根據(jù)具體情況而定。

每個模式生物各有利弊。為此，有必要在兩個以上不同模式生物中做平行實驗。為了全面揭示真核生物核小體的定位特點，我們分別選取一個單細(xì)胞生物和一個多細(xì)胞生物作為研究對象。原因在于:(1)酵母作為單細(xì)胞生物，其基因組較小，核小體的定位特征相對簡單，對其染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究及認(rèn)識也較為清楚［1－2］，能得到相對準(zhǔn)確而清晰的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)和圖譜。(2)果蠅胚胎期是一個由單細(xì)胞到多細(xì)胞的分化過渡的階段，研究這一時期的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，相對于直接研究分化后的果蠅成體困難要小得多。且與單細(xì)胞酵母細(xì)胞相比，果蠅胚胎期又具有某些單細(xì)胞生物的特點，因而在酵母染色質(zhì)研究中獲得的知識，可用于對果蠅的研究，二者具有可比性。(3)以往研究已經(jīng)通過實驗獲得了酵母與果蠅胚胎期的核小體占位率數(shù)據(jù)和H2AZ核小體定位數(shù)據(jù)［3］，因此研究具有可行性。

通過對現(xiàn)有實驗數(shù)據(jù)和實驗條件進(jìn)行綜合考察后，本文最終選取了在遺傳研究上最具代表意義的兩個模式生物:釀酒酵母(S.cerevisiae)和黑腹果蠅(D.melanogaster)［8］作為研究對象，希望通過比較分析這兩種生物的核小體定位數(shù)據(jù)［9］，得出有生物學(xué)意義的結(jié)論。對今后推廣到其他物種的核小體定位模式的研究有著極為重要的現(xiàn)實意義和實際應(yīng)用價值。事實也證明，通過對酵母和果蠅的相關(guān)基因組核小體的圖譜分析，我們發(fā)現(xiàn)了兩者的基因內(nèi)染色體組織架構(gòu)具有顯著的共同點與差異性。

1 實驗方法

1.1 數(shù)據(jù)準(zhǔn)備

本研究數(shù)據(jù)主要來自兩個部分:第一、酵母核小體定位實驗數(shù)據(jù)，包括Lee等人研究中給出的高分辨率核小體占位率實驗數(shù)據(jù)［2］，來自NCBI數(shù)據(jù)庫中的酵母16條染色體DNA編碼序列、David等人文獻(xiàn)中給出的4 792個高置信度酵母基因組實驗數(shù)據(jù)［1］，以及Albert等人實驗得到的 H2A.Z核小體位置數(shù)據(jù)［4］。第二部分果蠅的核小體定位的實驗數(shù)據(jù)，包括Mavrich等人在實驗中得到的果蠅胚胎期H2AZ核小體定位數(shù)據(jù)、總體核小體(bulk nucleosome)占位率數(shù)據(jù)［5］，以及 Pavel Tomancak 等人對果蠅胚胎期不同表達(dá)模式基因的分類數(shù)據(jù)［6］。由于以上核小體定位實驗數(shù)據(jù)來自不同實驗平臺，具有異構(gòu)性，我們根據(jù)研究目的利用信號處理方法對與本研究有關(guān)的數(shù)據(jù)進(jìn)行了重構(gòu)。

1.2 數(shù)據(jù)處理

1.2.1 核小體定位實驗數(shù)據(jù)的處理

(1)高分辨率核小體占位率實驗數(shù)據(jù)的處理

由于Lee等人提供的酵母高分辨率核小體占位率實驗數(shù)據(jù)來自每隔4 bp采樣的全基因組微陣列平臺 (an Affymetrix tiling microarray)［2］，而由 Travis N.Mavric等人提供的果蠅實驗數(shù)據(jù)卻是每隔36 bp采樣的全基因組微陣列數(shù)據(jù)［5］。在此，我們通過插值方法得到一個覆蓋全基因組每1 bp的核小體占位率數(shù)據(jù)，以供后續(xù)對齊使用。通過三次樣條插值(spline)，我們得到了精度較高，平滑度較好的包括了酵母16條染色體的實驗預(yù)備數(shù)據(jù)。由于果蠅數(shù)據(jù)的間隔較大(36 bp)，因此獲得的果蠅6條染色體的實驗預(yù)備數(shù)據(jù)精度相對于酵母要低一些。

(2)H2AZ核小體定位數(shù)據(jù)的處理

由于Albert等人提供的酵母H2A.Z核小體定位原始實驗數(shù)據(jù)和由Travis N.Mavric等人同時提供了果蠅胚胎期基因組的H2A.Z核小體定位原始實驗數(shù)據(jù)，都包括了H2A.Z核小體的起始位點、終止位點以及一些核小體的物理性質(zhì)數(shù)據(jù)。正是因為其中核小體的位置以及與其定位強(qiáng)度有關(guān)的物理性質(zhì)恰好符合高斯分布的特性，我們認(rèn)為具有良好的數(shù)理統(tǒng)計規(guī)律特性的高斯分布能很好的應(yīng)用在核小體的定位研究上。我們利用高斯分布圖形對核小體定位數(shù)據(jù)進(jìn)行重建，這高斯分布公式如下:

在每一個核小體的位置上構(gòu)造一個高斯分布圖形(見圖1)，期望值取核小體定位數(shù)據(jù)的中點，并且基于高斯分布中的“2σ原則”，我們將標(biāo)準(zhǔn)差取為核小體長度的1/4，以最大限度的減少誤差。最后，利用實驗數(shù)據(jù)中的峰值數(shù)據(jù)(peakhigh)作為這個核小體高斯分布的中點值，peakhigh是表示該核小體存在于這個位置的可能性大小的物理性質(zhì)。

圖1 核小體定位的正態(tài)分布重構(gòu)示意圖Fig.1 Normal distribution reconstruction graph of the Nucleosome positioning

1.2.2 基因數(shù)據(jù)的重構(gòu)

由Pavel Tomancak等人提供的果蠅原始實驗數(shù)據(jù)包括了不同表達(dá)模式型的基因的名稱數(shù)據(jù)［6］，結(jié)合Travis N.Mavric等人提供的基因位置數(shù)據(jù)［5］，分離出不同類表達(dá)模式基因的位置，包括廣泛表達(dá)型(broad)的2 627條基因、限制性表達(dá)型(restrict)的2 085條基因、沉默型(silent)的8 941條基因。

1.2.3 基于中心對齊的基因排序

通過前期處理和篩選，得到了酵母和果蠅全體基因組(所有基因)、果蠅廣泛表達(dá)基因組(胚胎期所有時期均被翻譯)、果蠅限制性表達(dá)基因組(胚胎期部分時期被翻譯，部分時期不被翻譯)、果蠅沉默型基因組(胚胎期不被翻譯)中的基因位置數(shù)據(jù)。這些組數(shù)據(jù)包括基因所在染色體上的位置，基因的起始位點和終止位點，基因正轉(zhuǎn)錄(W型)和反轉(zhuǎn)錄(C型)情況。

為了得到以上每組基因的一個二維繪圖(hot map)。首先分別將每組基因按照基因長度從小到大依次遞增的原則進(jìn)行重排列，并提取每條基因的中心點，這樣我們得到各組由短基因到長基因排列的基因位置數(shù)據(jù)。其次將此類位置數(shù)據(jù)分別映射到酵母和果蠅的全核小體占位率數(shù)據(jù)與H2A.Z核小體的定位數(shù)據(jù)中。在各條染色體上找到每條基因的中心點，并在每個基因的中心點周圍，截取上、下游各Nbp的長度范圍的核小體占位率數(shù)據(jù)或在該范圍內(nèi)含H2A.Z核小體的定位數(shù)據(jù)，取N的原則為各組基因中20%的最長基因的平均值。最后對截取的數(shù)據(jù)進(jìn)行中心對齊(其中C型基因?qū)?yīng)的數(shù)據(jù)要進(jìn)過反向處理)排列，這樣就得到了每組基因中心對齊的核小體的定位數(shù)據(jù)。將對齊后的數(shù)據(jù)進(jìn)行二維繪圖(hot map)，由此得到了各組基因中心對齊的核小體的定位圖譜。

1.2.4 圖譜

這里用hot map繪圖法繪出以下多組二維繪圖(hot map)，展示了一個明顯的、有組織的核小體排列序列。我們從不同層次、從外到內(nèi)、從頂端到低端、從最短基因到最長基因的去分析，有組織的核小體的剖面圖被生動形象的展現(xiàn)出來。

從圖2A中很明顯的觀測到酵母中基因5’端處的邊界顯示強(qiáng)度明顯比基因3’端邊界顯示強(qiáng)度大，這一點與Cedric Vaillant等人的關(guān)于酵母全體基因上發(fā)現(xiàn)的規(guī)律一致，即在核小體缺失區(qū)域(NFR)的基因3’端的存在著5個核小體影響著基因，在核小體缺失區(qū)域(NFR)基因5’端則存在著7個核小體的影響著基因［7］。然而，圖2B中所顯示出來的果蠅全體基因的中心點周圍H2A.Z核小體分布圖中，基因5’端的邊界卻與基因3’端的邊界顯示出輪廓對稱，且顯示強(qiáng)度也一致，這一點與酵母中觀察到的完全不同。在酵母中，一般認(rèn)為H2A.Z核小體與基因的轉(zhuǎn)錄相關(guān)，并且傾向于定位在具有轉(zhuǎn)錄活性的基因5＇端。但是在果蠅胚胎中看到的情況卻是;基因5＇端核小體缺失區(qū)域(NFR)與基因3’端核小體缺失區(qū)域(NFR)兩側(cè)具有同樣數(shù)目或至少是數(shù)目相差不H2AZ核小體，且邊界上的核小體數(shù)量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過酵母。

這種從單細(xì)胞生物到多細(xì)胞生物間的差異性，體現(xiàn)了生物界中的進(jìn)化特性。從果蠅胚胎的H2A.Z核小體分布看，單細(xì)胞生物和多細(xì)胞生物有著顯著差別。原因在于當(dāng)果蠅胚胎處于不同發(fā)育階段時，一些基因必須嚴(yán)格按發(fā)育程序保持的沉默，否則對幼蟲可能是致命的。這就需要果蠅進(jìn)化出比單細(xì)胞生物酵母更為復(fù)雜的染色體調(diào)控機(jī)制。因此，H2A.Z核小體在酵母中的作用可能在果蠅中只得到了部分保留。

圖2 酵母與果蠅全基因中心點周圍H2A.Z核小體分布Fig.2 H2A.Z nucleosome distribution around the center point of genes in Yeast and Drosophila

圖3為酵母和果蠅果蠅胚胎期沉默型基因中心點周圍H2A.Z核小體分布圖，這里選取果蠅果蠅胚胎期沉默型基因組圖是因為它表現(xiàn)出的特征是最明顯的。從圖3A中可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)L＜1.5 kbp時，在核小體缺失區(qū)域的兩個邊界處呈現(xiàn)出明顯的周期性包裝，并且出現(xiàn)了一個定義明確有著均勻間隔的核小體數(shù)n。隨著L的增加，這種晶體狀的基因簇在基因區(qū)域呈現(xiàn)出與核小體相同的數(shù)目n(2＜n＜10)。對于L＞1.5 kbp的基因，周期性核小體的位置是可見的，但因受兩邊界的誘導(dǎo)，顯示周期性規(guī)律的中心點處核小體位置所需的強(qiáng)力限制性減弱，從而使周期性出現(xiàn)比較模糊現(xiàn)象。從圖3B果蠅中同樣可以發(fā)現(xiàn)酵母中發(fā)現(xiàn)的規(guī)律，但是較酵母所表現(xiàn)的出來的更模糊更復(fù)雜的圖像。

圖3 酵母全基因和果蠅胚胎期沉默型基因中心點周圍H2A.Z核小體分布Fig.3 H2A.Z nucleosome distribution around the center point of genes in silent gene of Yeast and Drosophila embryo

圖4為酵母和果蠅果蠅胚胎期沉默型基因中心點周圍核小體占位率分布，從圖4A中也發(fā)現(xiàn)了前面兩組A圖中發(fā)現(xiàn)的兩個核小體排列特征，并且此圖更為清晰明確。而圖4B中卻只能看到一個兩個核小體確實區(qū)域所組成的輪廓。原因之一可能是酵母高分辨率核小體占位率實驗數(shù)據(jù)來自每隔4 bp采樣的全基因組微陣列平臺，而果蠅實驗數(shù)據(jù)卻是每隔36 bp采樣的全基因組微陣列平臺，其精度相差太大。原因之二可能就是果蠅較酵母是更高級的生物，其基因組織結(jié)構(gòu)也更復(fù)雜，這也解釋了前一組圖組果蠅的周期性比酵母模糊的疑問。

圖4 酵母和果蠅胚胎期沉默型全基因中心點周圍全部核小體占位率分布Fig.4 The occupancy rate distribution of all nucleosome around the center point of genes in yeast and silent genes in Drosophila

2 結(jié)論

本文從高分辨率核小體占位率實驗數(shù)據(jù)和H2AZ核小體定位數(shù)據(jù)分別去研究酵母和果蠅胚胎期核小體定位及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)不同物種和同一物種中不同表達(dá)模式的基因與全體基因上，核小體分布會呈現(xiàn)出不同的特征。酵母全體基因中核小體對NFR的基因3’端影響較NFR基因5’端影響小，果蠅的全體基因中核小體對NFR的基因3’端影響較NFR基因5’端影響卻是一樣的。酵母與果蠅胚胎期沉默型基因的核小體缺失區(qū)域的兩個邊界中間處都出現(xiàn)了一個明確有著均勻間隔的核小體數(shù)n，且隨著基因長度L的變長其周期性特性逐漸變模糊，只是果蠅相對來說比酵母的更為復(fù)雜和模糊。

上面所述的差異性體現(xiàn)了在‘硬’遺傳和‘軟’遺傳方面，兩個物種基因組進(jìn)化的不同。在‘軟’遺傳方面，發(fā)現(xiàn)了核小體在兩個物種啟動子和終止子區(qū)的核小體缺失區(qū)域在范圍上的差異性;在‘硬’遺傳方面，揭示了兩個物種與‘硬’遺傳上所呈現(xiàn)的相關(guān)的核小體數(shù)目與位置上的進(jìn)化差異。結(jié)果表明，從單細(xì)胞酵母生物到多細(xì)胞果蠅生物間基因組的進(jìn)化過程中，核小體組織的演化既有變異性，也具有保守性。

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