趙紅艷，金甫東，李世平，史俊友

（曲靖師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，云南 曲靖 655011）

有機(jī)磷農(nóng)藥（OPS）是一類含有機(jī)磷原子的有機(jī)酯類化合物，在我國(guó)使用最廣泛、用量最大的殺蟲劑。因此，它對(duì)環(huán)境生物安全和人類健康會(huì)產(chǎn)生較大的危害[1]。對(duì)于有機(jī)磷農(nóng)藥的快速檢測(cè)也成為食品衛(wèi)生科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前，絕大多數(shù)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)都是基于膽堿酯酶抑制這一原理[2]。但膽堿脂酶來(lái)源于動(dòng)物體，價(jià)格貴，保存較為困難。植物酯酶來(lái)源廣、成本低、易保存。近年來(lái)已有用植物酯酶檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的報(bào)道[3-4]。研究所使用的酶源大多以小麥、玉米等種子植物為主，酶源的選擇上有一定的局限。本實(shí)驗(yàn)選擇富含淀粉的塊莖農(nóng)作物土豆(Solanum tuberosum)、紅薯(Ipomoea batatas)、茨菇(Sagittaria sagittifolia)、芋頭[Colocasia esculenta(L.)Schoot]、蓮藕(Nelumbo nuciferaG.)為原材料來(lái)提取植物酯酶，旨在擴(kuò)大酶源，為酶源的選擇提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料、試劑和儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料土豆、紅薯、茨菇、芋頭、蓮藕均購(gòu)自菜市場(chǎng)。

1.1.2 試劑和儀器固藍(lán)B鹽、乙酸-1-萘酯、1-萘酚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙醇均為分析純；敵敵畏、樂(lè)果、殺撲磷、甲胺磷、毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品(農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所研制）。

TU-1810紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；TGL-16C高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XMT-DA數(shù)顯調(diào)節(jié)儀（姚奧特儀表有限公司）；CJJ78-1磁力加熱攪拌器；AL204-IC電子天平（梅特勒-托多利儀器有限公司）；PHS-3C精密pH計(jì)等。

1.2 方法

1.2.1 酶液的提取酯酶的提?。簩⒃牧希ㄍ炼?、紅薯、茨菇、芋頭、蓮藕）洗凈去皮稱取適量研細(xì)，按料液比以1∶5加入pH6.5的磷酸鹽緩沖溶液于燒杯中混合，在磁力加熱攪拌器上攪拌上30min后，4℃下浸泡16 h，4層紗布過(guò)濾，靜置取上清液在5 000 r/min的離心機(jī)上離心10min，上清液于4℃下保存，備用。

1.2.2 酶促反應(yīng)適宜條件該試驗(yàn)根據(jù)前人研究，通過(guò)單因素試驗(yàn)，對(duì)酶促反應(yīng)的最適合波長(zhǎng)、最適底物用量、最適pH值、最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)時(shí)間、酶液的最佳稀釋倍數(shù)進(jìn)行選擇優(yōu)化。

1.2.3 總酯酶活力和比活力的測(cè)定方法

1.2.3.1 1-萘酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[5]配制1-萘酚無(wú)水乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的系列濃度，加pH6.5磷酸鹽緩沖溶液至3mL，然后加0.5mL固藍(lán)B鹽溶液，混合均勻，于30℃恒溫水浴保溫10min。用緩沖液作空白,在532 nm處讀取以上反應(yīng)液的吸光度。以濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線其斜率為：

（1）式中，K為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，Ci為1-萘酚溶液濃度，ODi為反應(yīng)液在532 nm 處的吸光度(OD)，n為標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度點(diǎn)數(shù)。

1.2.3.2 總酯酶活力的測(cè)定[6-7]在試管中依次加入各自最適合的乙酸-1-萘酯丙酮溶液用量和0.5mL稀釋后的酶液，1.95mL磷酸鹽緩沖溶液。把試管放入各自最適溫度的恒溫水浴中反應(yīng)相應(yīng)最適時(shí)間。在其中加入0.5mL固藍(lán)B鹽溶液。放入30℃的恒溫水浴中反應(yīng)10min。在相應(yīng)波長(zhǎng)處測(cè)定溶液吸光度。根據(jù)1-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)得的吸光度可以得到總酯酶活力的計(jì)算式為:

（2）式中，E為每毫升酶液所含的總酯酶活力(U/mL)；D為酶液的稀釋倍數(shù)；K為對(duì)應(yīng)pH下1-萘酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；OD為反應(yīng)后在相應(yīng)波長(zhǎng)處測(cè)得的吸光度；U為酶活力單位，1U定義為在規(guī)定條件下每分鐘催化得到1 moL 1-萘酚所需的酶量。

1.2.3.3 比活力的測(cè)定[8]蛋白質(zhì)含量測(cè)定：以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定酶液的蛋白含量

2.3.5 對(duì)不同農(nóng)藥敏感性及最低檢測(cè)限的測(cè)定[9-10]分別配制1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04mg/mL系列質(zhì)量濃度的有機(jī)磷農(nóng)藥(均折算成純化學(xué)物質(zhì)含量)，按總酯酶活力測(cè)試步驟，將1.950mL含有不同質(zhì)量濃度農(nóng)藥的緩沖液取代不含農(nóng)藥的緩沖液，測(cè)試不同農(nóng)藥對(duì)植物酯酶的抑制程度，其計(jì)算式為：

（4）式中，I為抑制率，E1為無(wú)農(nóng)藥抑制時(shí)酶液酯酶活性，E2為某一濃度農(nóng)藥抑制時(shí)酶液酯酶活性。將酯酶對(duì)農(nóng)藥的靈敏度定義為曲線的斜率K＇。將農(nóng)藥濃度取對(duì)數(shù)值，并以之為橫坐標(biāo)對(duì)抑制率作圖，得曲線的斜率為：

（5）式中，K'為該酯酶對(duì)農(nóng)藥的靈敏度，Ci為農(nóng)藥物質(zhì)的量濃度(mol/L)，Ii為農(nóng)藥濃度為Ci時(shí)的抑制率，n為曲線的測(cè)試濃度點(diǎn)數(shù)。

根據(jù)所使用分光光度計(jì)的誤差范圍和國(guó)家規(guī)定的最大殘留限量(MRL)，以可以檢測(cè)到的最小農(nóng)藥濃度為初定檢測(cè)限，在此濃度下與空白反應(yīng)液定值進(jìn)行t檢驗(yàn)(n=6)，確定植物酯酶對(duì)各種有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的最低檢測(cè)限[7]。

2 結(jié)果與討論

2.1 土豆、紅薯、茨菇、芋頭、蓮藕酯酶檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的條件探索

2.1.1 酶促反應(yīng)最適波長(zhǎng)對(duì)各反應(yīng)體系進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，得土豆、紅薯、茨菇、芋頭、蓮藕的最大吸收波長(zhǎng)分別為534 nm，532 nm，533 nm，532 nm、475 nm，此時(shí)的酶活性最高。

2.1.2 酶促反應(yīng)最適底物乙酸-1-萘酯的用量分別以土豆、紅薯、茨菇、芋頭、蓮藕的酯酶進(jìn)行酶促反應(yīng)，當(dāng)?shù)孜镉昧糠謩e為0.50mL、0.50mL、1.00mL、0.50mL、0.50mL時(shí)吸光度值最大，相應(yīng)酶活性最高。

2.1.3 最適合酶促反應(yīng)pH值用pH值為3.5-7.0磷酸鹽緩沖液配制酶反應(yīng)體系。得到土豆、紅薯、茨菇、芋頭、蓮藕的酯酶在pH分別為5.5、6.5、6.5、6.0、6.5 h，酶活性最高。

2.1.4 最適反應(yīng)溫度將酶促反應(yīng)體系置于30~60℃的恒溫水浴中反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)證明，土豆、紅薯、茨菇、芋頭、蓮藕酯酶的最佳酶催化反應(yīng)溫度分別為45℃、40℃、40℃、45℃、40℃。

2.1.5 最適反應(yīng)時(shí)間將酶促反應(yīng)體系于45℃下水浴恒溫5~40min。得土豆、紅薯、茨菇、芋頭、蓮藕酯酶的酶催化反應(yīng)最佳時(shí)間分別為13min、25min、25min、5min、15min。

2.2 總酯酶活力的比較

植物酯酶水解底物乙酸-1-萘酯生成乙酸和1-萘酚，1-萘酚與固藍(lán)B鹽作用生成紫紅色的偶氮化合物。做出1-萘酚含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)總酯酶活力的計(jì)算公式，即可計(jì)算得到植物酯酶的總活力。從圖1可知，土豆、紅薯、茨菇、芋頭、蓮藕的總酯酶活力分別為8.462 3、3.102 2、8.743 7、4.268 0、7.491 0，土豆、茨菇、蓮藕的總酯酶活力相對(duì)較高，適宜做酶源。

圖1 總酯酶活力的比較

圖2 酯酶比活力

2.3 比活力的測(cè)定

用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定不同酶源的蛋白含量，得到斜率，由比活力的計(jì)算方法，得到各植物酯酶土豆、紅薯、茨菇、芋頭、蓮藕的比活力分別為5.459 3、2.367 7、4.482 3、2.978 2、5.295 3 U/mg，如圖2所示，由圖可知土豆、茨菇、蓮藕的比活力相對(duì)較高，適宜做酶源。

2.4 可行性與靈敏度

分析方法的靈敏度，是指方法本身能測(cè)得被測(cè)成分的最低限量。一般用最小檢出量或最低濃度表示。微量分析方法要求靈敏度越高越好[8]。在本試驗(yàn)確定的最佳反應(yīng)條件下測(cè)定了5種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留，以抑制率對(duì)農(nóng)藥濃度的對(duì)數(shù)做工作曲線，線性方程及靈敏度見表1~3，由表可知，隨著農(nóng)藥濃度的增加，抑制率增大，酶活性降低。由于各種農(nóng)藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，對(duì)同一酯酶的抑制程度不同；不同的植物酯酶所含成分不同，所含淀粉量不同，故同種農(nóng)藥對(duì)不同的酯酶的抑制程度也不盡相同。除甲胺磷對(duì)茨菇酯酶酶活性抑制不佳外，其它最小檢出量（LOD）都遠(yuǎn)低于國(guó)家規(guī)定的最大殘留限量(MRL)，完全可以滿足實(shí)際檢測(cè)的需要。相比敵敵畏、甲胺磷、樂(lè)果、毒死蜱，殺撲磷對(duì)酶的抑制率最高，靈敏度最好，高達(dá)67.622。

表1 土豆酯酶對(duì)農(nóng)藥的敏感性和最低檢出限

表2 茨菇酯酶對(duì)農(nóng)藥的敏感性和最低檢出限

表3 蓮藕酯酶對(duì)農(nóng)藥的敏感性和最低檢出限

3 討 論

本試驗(yàn)在選材上有較大突破，對(duì)淀粉含量高的塊莖類植物酯酶活性進(jìn)行了初步探討。通過(guò)對(duì)5種塊莖類植物的總酯酶活力、比活力、農(nóng)藥敏感性和最低檢測(cè)限的進(jìn)行了探索，通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)土豆、茨菇、蓮藕的總酯酶活力和比活力都比較高。通過(guò)對(duì)5種有機(jī)磷類農(nóng)藥的敏感性試驗(yàn)可以得出，土豆、蓮藕和茨菇對(duì)農(nóng)藥敏感性高，最低檢測(cè)限(LOD)小于國(guó)家規(guī)定的MRL值，符合檢測(cè)要求，證明其作為農(nóng)藥殘留檢測(cè)用酶源是可行的。

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