陳駿 ，施介華 ，2

（1.浙江工業(yè)大學藥學院，浙江杭州 310012；2.浙江工業(yè)大學綠色化學合成技術國家重點實驗室培育基地，浙江杭州 310032）

脫氧核糖核酸（DNA）是人體中最為重要的生物大分子，是生命的基礎。DNA通過復制、轉錄、翻譯形成蛋白質，蛋白質通過直接參與生物體內的催化、免疫、代謝過程，物質轉運，信息傳遞以及運動和生物調控來協(xié)調人體的生命過程。而隨著化學工業(yè)的發(fā)展，不經(jīng)合理排放的印染廢水［1］，濫用的農藥［2］以及工業(yè)生產產生的有毒氣體、有毒物質中的有機小分子有可能會直接或者間接地對DNA造成損傷，從而致畸致癌致突變［3］。同時，Laureen C.Colis［4］發(fā)現(xiàn)一種由海洋細菌產生的有機小分子lomaiviticin A能夠通過破壞DNA的方式來殺滅癌細胞，這一發(fā)現(xiàn)或許可以為新型化療藥物的開發(fā)鋪平道路。因此，研究有機小分子與DNA相互作用的過程有助于明確有機小分子是否存在致癌作用以及具體的致癌機理，并為癌癥的預防，綠色化合物的設計等提供理論基礎。在科研實驗中，由于人體DNA不易提取和保存，因此常用同源性非常高的小牛胸腺DNA （ct－DNA）來替代人體DNA。本文概述了有機小分子與DNA的結合模式及表征手段，并介紹了分子模擬在這一方面的應用。

1 有機小分子與DNA結合的模式

有機小分子與DNA之間的結合方式主要包括共價結合與非共價結合。其中共價結合［5］是指靶向化合物與DNA中的堿基、糖和磷酸酯鍵形成共價鍵，主要表現(xiàn)為DNA的烷基化、DNA的鏈間交聯(lián)和DNA的鏈內交聯(lián)，例如作為雙功能烷化劑的環(huán)磷酰胺即能通過鏈內交聯(lián)的方式與DNA發(fā)生交叉聯(lián)結，從而能夠抑制DNA的合成。大多數(shù)的有機小分子與DNA的結合方式是非共價結合，而非共價結合［6］主要包括三類（靜電作用、溝區(qū)結合、嵌入結合），如圖1所示。靜電作用是指有機小分子能與DNA的磷酸根基團相互作用，這種作用主要結合于DNA的外壁，常與溝區(qū)結合和嵌入結合方式同時并存，以起到輔助的結合作用，其本身沒有特異性。溝區(qū)結合是指有機小分子通過范德華力與氫鍵作用與DNA溝區(qū)的A－T結合位點相結合，有機小分子通常結合于DNA的小溝區(qū)。嵌入結合是指一個分子的平面稠環(huán)部分嵌入到DNA的兩個堆積的堿基對之間，其作用力主要是π－π＊共軛作用及疏水作用，嵌入結合相對于溝區(qū)結合方式最大的特點在于其會使DNA的構象發(fā)生變化，從而使DNA不能輕易地復制而產生抗病毒抗腫瘤的作用，但由于嵌入作用會損害DNA的構象，因此嵌入結合同時也被看作是一種致癌的因素。

圖1 有機小分子與DNA的不同結合模式

2 表征手段

2.1 紫外光譜法

紫外光譜法是研究有機小分子與DNA相互作用最為常用的一種方法，它能夠快速地檢測出隨著DNA濃度變化時有機小分子可能會發(fā)生的變化。嵌入作用會使配體與堿基對產生π電子堆積，使能量下降，產生紅移效應；同時，耦合后的π＊軌道因部分填充電子，使π－π＊躍遷幾率減小，產生減色效應，因此紅移減色效應為嵌入結合的特征之一［7］。而當藥物小分子與DNA以溝區(qū)結合作用的時候，只會出現(xiàn)減色效應而不會出現(xiàn)紅移效應，出現(xiàn)減色效應的原因可能是藥物小分子的發(fā)色團被DNA的含氮堿基所覆蓋導致。Nahid Shahabadi［8］在運用紫外光譜法研究中性紅（NR）與ct－DNA的相互作用時發(fā)現(xiàn)中性紅在464 nm處發(fā)生減色紅移效應，從而驗證了中性紅與ct－DNA的相互作用是嵌入結合作用。

2.2 熒光光譜法

由于熒光光譜法較紫外光譜法的靈敏度更加高，且不易受到環(huán)境的干擾，因此熒光光譜法是研究有機小分子與DNA相互作用的重要手段，目前被廣泛應用于科研工作中。

DNA自身的熒光很弱，不適合直接觀察DNA熒光強度的變化情況，如果有機小分子本身具有熒光特性，可根據(jù)加入DNA前后有機小分子的發(fā)射光譜圖的變化來研究有機小分子與DNA相互作用的過程，并能據(jù)此得到二者之間的結合常數(shù)。如果有機小分子的熒光效率也很低，那么必須借助于熒光探針如經(jīng)典的嵌入結合探針溴化乙錠（EB）、溝區(qū)結合探針Hoechst－33258來觀察有機小分子與DNA的結合情況。EB含有一個可以嵌入DNA堆積堿基之間的一個三環(huán)平面基團，而Hoechst－33258結合于DNA的AATC位點。在研究有機小分子與DNA的作用中，常常使用EB［9］、Hoechst－33258［10］作為 DNA 的分子探針，這是因為它們與DNA結合后能夠使熒光增強，若有機小分子嵌入結合于DNA中，則會使DNA－EB中的部分 EB被競爭游離出，因此DNA－EB復合物的濃度降低，其熒光強度相應降低。若有機小分子結合于DNA的A－T溝區(qū)結合位點，會與Hoechst－33258產生競爭作用，使熒光強度降低。這同時也是一種判斷有機小分子與DNA結合方式的一種手段。Soheila Kashanian［11］等人利用氟西汀自身的熒光特性通過熒光光譜法得到氟西汀溝區(qū)結合于ct－DNA。而由于左拉乙西坦與DNA的熒光特性都很弱，因此需要使用到熒光探針。Nahid Shahabadi［12］等人發(fā)現(xiàn)隨著左拉乙西坦?jié)舛鹊脑龈?，DNA－Hoechst 33258復合物的熒光強度逐漸降低，表明左拉乙西坦與Hoechst 33258競爭結合于DNA。

2.3 圓二色光譜法

圓二色性是指物質對左旋圓偏振光與右旋圓偏振光吸收率不同所表現(xiàn)出的性質，圓二色譜是研究生物大分子構象的強有力的工具。

DNA是有旋光性的生物大分子，B型DNA的特征圓二色譜峰在 209、221、245、275 nm［13］；DNA在275 nm的時候呈現(xiàn)的是因為堿基堆積造成的正峰，245 nm處的負峰是由于雙螺旋結構造成。通過觀察位于245 nm、275 nm處的峰位置與峰強度的變化，可判斷出有機小分子與DNA的作用方式。Xiangyu Xu［14］等人應用圓二色光譜法研究了氟尿嘧啶、喃氟啶與ct－DNA的相互作用。結果表明，ct－DNA在245 nm、275 nm處的負峰和正峰發(fā)生了輕微的位移，并且245nm處峰強度減弱，表明氟尿嘧啶、喃氟啶對ct－DNA的構象產生了明顯的影響，275 nm處的峰強度減弱表明堿基堆積作用減弱。

2.4 紅外光譜法

紅外光譜是研究分子運動的吸收光譜，它可以用于化合物分子結構的測定、未知物的鑒定以及混合物成分的分析。通過紅外光譜法分析DNA－有機小分子體系中混合物成分的變化情況，可以判斷DNA與有機小分子的結合作用方式。DNA［15］在 1710 cm－1、1662 cm－1、1613 cm－1、1492 cm－1的面內振動分別歸屬于 G、T、A、C，1226 cm－1歸屬于PO2的對稱伸縮振動，1088 cm－1歸屬于PO2的不對稱伸縮振動，834、936 cm－1的峰歸屬于 B型DNA的構型特征峰，若是溝區(qū)結合，則在1662 cm－1與1610 cm－1處的峰位置和峰強度會有相應的變化。另外觀察磷酸根離子在1226 cm－1與1088 cm－1處的吸收峰位置與強度的變化，可判斷是否存在靜電結合作用，觀察834、936 cm－1的峰位置與峰強度的變化，可以推斷DNA的構型是否發(fā)生了變化。Guowen Zhang［16］等對比芍藥苷加入前后DNA紅外光譜圖譜的變化，發(fā)現(xiàn)歸屬于胸腺嘧啶的1662 cm－1和歸屬于腺嘌呤的 1613 cm－1分別藍移到 1656 cm－1和 1609 cm－1， 而這兩個峰的峰強度增強，表明芍藥苷直接結合于腺嘌呤（N7）與胸腺嘧啶（O2），歸屬于鳥嘌呤、胞嘧啶和磷酸根離子處的吸收峰并沒有發(fā)生變化，表明不存在靜電結合作用，芍藥苷也沒有與鳥嘌呤、胞嘧啶相互作用，此外，834、 936 cm－1并沒有變化，表明DNA的構象沒有受到影響。

2.5 粘度法

粘度法因其操作簡單、造價低廉、結果易得的特點使得它常常作為研究藥物分子與DNA結合方式的輔助手段。有機小分子以嵌入方式作用DNA時，會使堿基對的距離增加，粘度系數(shù)增加，使溶液的粘度增加；有機小分子以非嵌入方式作用于DNA時，對溶液的粘度影響不大；而當有機小分子以部分嵌入方式作用于DNA時，DNA的雙螺旋結構發(fā)生嚴重扭曲，從而使得粘度減小。粘度法常常作為驗證DNA與藥物結合方式的手段而被使用。白菊［17］等人利用粘度法研究了GD（III）－EBBR配合物與鯡魚精子DNA的作用方式，結果加入GD （III）－EBBR配合物后DNA的粘度減小，表明GD（III）－EBBR配合物以部分嵌入結合作用于DNA。

2.6 電化學方法

電化學方法也常常被用于作為研究有機小分子與DNA相互作用的一種方法，其中循環(huán)伏安法最為常用。有機小分子與DNA結合之后，會表現(xiàn)在循環(huán)曲線所得的式量電位的移動，當電活性的分子式量電位正移時，代表有機小分子嵌入于DNA，式量電位負移代表有機小分子靜電結合于DNA，若式量電位不發(fā)生移動，代表有機小分子與DNA 以溝區(qū)模式相結合［18］。劉偉［19］等人設計合成了 3，5－二碘水楊醛縮 4，4’－二氨基二苯甲烷雙席夫堿的 Cu（Ⅱ）和 Mn（Ⅱ）的配合物，并用循環(huán)伏安法表征了兩種配合物與DNA的結合模式。結果表明，兩種配合物的氧化峰點位均發(fā)生了不同程度的正移，且峰電流減少，表明兩種配合物以嵌入結合與DNA鍵合，使得單位時間內遷移到電極表面的配合物分子數(shù)量減少。

3 分子模擬

利用計算機輔助觀察有機小分子與DNA之間的相互作用，在近幾年來發(fā)展得十分迅速，特別是DNA大分子數(shù)據(jù)庫的建立更加促進了分子模擬的發(fā)展。分子對接是計算機輔助藥物設計的一種方法，通過分子對接可以直觀地觀察到有機小分子與DNA的結合方式，并用以支持實驗得到的結果，有助于從原子水平上了解有機小分子與DNA的作用方式。分子對接根據(jù)體系中分子構象的變化可以分為三種：柔性對接、半柔性對接和剛性對接。在柔性對接方式下，體系中所有分子的構象都可以自由地變化，這種對接方式所耗費的時間很長。半柔性對接允許體系中的分子（特別指配體）在一定的范圍內活動，使用這種方式進行對接時，一般是固定大分子的構象，變化小分子的構象，這種對接方式也是目前常用的一種對接方式。剛性對接是指體系中的分子的構象都是固定不變的，這種對接方式比較適合于大的體系，例如蛋白與核酸之間的對接。作為半柔性對接軟件中的代表，開源軟件Autodock在有機小分子與DNA相互作用的研究中應用得十分廣泛。Autodock［20］采用的機理是固定大分子的構象，讓有機小分子在設置的合理區(qū)域里與大分子構象進行匹配，采用拉馬克遺傳算法與模擬退火相結合的方式來獲取有機小分子與生物大分子一系列具有合理構象的復合物，并使用打分函數(shù)對復合物進行打分，根據(jù)得到的最低結合自由能即能夠篩選出最穩(wěn)定的復合物，從而得到結合位點以及氫鍵等信息。

Sonika Charak［21］等人使用 Autodock 軟件對瘤可寧與DNA之間的結合信息進行探討，在進行了100次運算之后得到瘤可寧溝區(qū)結合于DNA，且瘤可寧的O18、O19與鳥嘌呤的N2發(fā)生了氫鍵結合，計算得到的結合結果與從紅外光譜上得到的結果一致。另外，計算得到的吉布斯自由能為－5.91 kcal／mol，而通過實驗得到的吉布斯自由能為－4.2 kcal／mol， 計算得到的結果和實驗得到的結果也較為匹配。Yocheved Gilad［22］等人用Autodock軟件將63種DNA嵌入結合的有機小分子進行對接以驗證結合模式，結果證明Autodock軟件能夠有效地區(qū)分溝區(qū)結合模式和嵌入結合模式，證明了Autodock軟件在辨別有機小分子與DNA結合模式上的可靠性。另外，將Autodock軟件與分子三維結構處理軟件結合在一起使用，可以快速、準確、直觀地處理大批量的實驗結果。Daniel Seeliger［23］等人將 PyMOL插件安裝到Autodock軟件上，不僅保存了原有的Autodock軟件功能，同時在對接的準備，運行以及結果分析上增加了額外的如3D可視化、虛擬篩選分析等功能，這簡化了Autodock軟件的操作，并豐富了Autodock軟件的功能運行。

4 展望

相對于利用傳統(tǒng)的實驗方法去研究有機小分子與DNA的相互作用，利用分子模擬更加方便、快捷，并且節(jié)省實驗資源，同時能夠大批量地進行研究總結，從而找出實驗規(guī)律，為設計低毒性的化學分子提供理論基礎。因此，在未來，隨著研究的深入以及大分子數(shù)據(jù)庫的不斷擴充，分子模擬必將替代傳統(tǒng)的實驗方法，成為主流的科研手段。

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