鄭燕林 劉聰慧 沙菽

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases MMPs)是一個Zn+依賴性蛋白酶家族，產(chǎn)生于正常組織細(xì)胞(包括結(jié)締組織細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等)和腫瘤細(xì)胞，以前酶形式分泌，于細(xì)胞外間隙激活后發(fā)揮作用。

研究已發(fā)現(xiàn)MMPs與血管新生［1-3］、腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移以及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的降解過程密切相關(guān)，是降解ECM的主要成份［4-7］。前期研究發(fā)現(xiàn)64 g·L－1水蛭提取液對體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞有抑制增殖作用［8］，為進(jìn)一步證明水蛭提取液對內(nèi)皮細(xì)胞微環(huán)境的作用，本實(shí)驗(yàn)擬采用酶聯(lián)免疫法(enzyme linked immunosorbent，ELISA)、放射免疫法檢測水蛭提取液對細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 MMP-2、IV型膠原(IV型膠原)表達(dá)的影響，初探水蛭提取液對新生血管生長的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 中藥水蛭提取液購自成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑科(批號:2007030201)，RF/6A(上海中科院細(xì)胞庫)，體積分?jǐn)?shù)為10%的特級胎牛血清(北京元亨公司)，1640干粉(GIBCO公司)，25 g·L－1胰蛋白酶(美國 Sigma公司)，MCD-15A 型二氧化碳培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)，JJT-900/1300型超凈工作臺(北京半導(dǎo)體設(shè)備廠)，XDS-1型倒置相差顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)，IV型膠原放射免疫試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)，MMP-2 ELISA試劑盒(上海森雄公司)，GC-1200放射免疫技術(shù)器(中國科大創(chuàng)新股份有限公司)，550酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 水蛭提取液的制備 取水蛭粗粉31.5 g，加體積分?jǐn)?shù)75%乙醇200 mL，使均勻潤濕，加蓋，放置2 h，裝入滲濾筒中。添加體積分?jǐn)?shù)75%乙醇高出藥面3 cm，排除筒內(nèi)空氣。加蓋放置48 h后放出藥液，流速3 mL·min－1，并從藥面不斷添加體積分?jǐn)?shù)75%乙醇5000 mL，滲濾液回收乙醇至無醇味，定容至50 mL，每毫升相當(dāng)于0.63 g原生藥，藥液經(jīng)60℃照射滅菌，備用。藥物使用前用直徑45 μm過濾器過濾。

1.2.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 細(xì)胞融合后，吸去舊的培養(yǎng)液，用PBS輕緩漂洗培養(yǎng)物1～2次，盡量洗去殘余的未貼壁的細(xì)胞及雜質(zhì)，棄平衡鹽溶液;加入2.5 g·L－1胰蛋白酶約 2 mL，于 37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中消化2～3 min;在倒置相差顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞皺縮變圓，細(xì)胞間隙變大，大部分細(xì)胞脫壁時，加入體積分?jǐn)?shù)10%RPMI 1640培養(yǎng)液2 mL終止消化;吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，反復(fù)有序、輕柔吹打培養(yǎng)瓶壁細(xì)胞，脫壁后形成細(xì)胞懸液，室溫下1000 r·min－1離心 3 min，棄上清液;按 1∶3 的比例接種于新的培養(yǎng)瓶中。送入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，2～3 d換液1次?？瞻准?xì)胞以無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，凝血酶組細(xì)胞以含20 U·mL－1的培養(yǎng)液培養(yǎng)，水蛭組細(xì)胞以含水蛭提取液64 g·L－1培養(yǎng)液培養(yǎng)，合藥組細(xì)胞以含凝血酶20 U·mL－1水蛭提取液 64 g·L－1培養(yǎng)。

1.2.3 檢測指標(biāo) 選擇生長良好的細(xì)胞，2.5 g·L－1胰蛋白酶消化后，用含體積分?jǐn)?shù)10%RPMI1640培養(yǎng)液重新計(jì)數(shù)調(diào)整，以2×104mL－1濃度接種于96孔培養(yǎng)板。每組設(shè)18個復(fù)孔，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱孵育48 h，吸盡舊培養(yǎng)液，PBS洗滌。每孔加入 200 μL 共同培養(yǎng)，于作用后 2 h、6 h、12 h，各取培養(yǎng)液 200 μL，3000 r·min－1高速離心 10 min，使細(xì)胞、碎片沉淀，取上清，用于檢測指標(biāo)。用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定不同時間點(diǎn)培養(yǎng)液中MMP-2的含量(按試劑盒步驟進(jìn)行操作)。用放射免疫的方法測定不同時間點(diǎn)培養(yǎng)液中Ⅳ-C的含量(按試劑盒步驟進(jìn)行操作)。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 對本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMP-2檢測結(jié)果 由表1可知，2 h、6 h時各組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05)。12 h時各組間比較，空白組、水蛭組 MMP-2的表達(dá)低于凝血酶組，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為 P＜0.05);空白組與水蛭組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);合藥組與空白組、水蛭組、凝血酶組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05)。

表1 不同時間點(diǎn)各組MMP-2含量OD值比較Table 1 Comparison of OD value of MMP-2 in different group at different time points(，n=6)

表1 不同時間點(diǎn)各組MMP-2含量OD值比較Table 1 Comparison of OD value of MMP-2 in different group at different time points(，n=6)

Group 2 hours 6 hours 12 hours Normal 0.147±0.006 0.148±0.004 0.137±0.006 Leech 0.151±0.006 0.135±0.003 0.136±0.007 Mixing 0.148±0.017 0.148±0.011 0.156±0.012 Thrombin 0.150±0.014 0.155±0.018 0.165±0.018

空白組12 h時 MMP-2含量低于2 h、6 h，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)，2 h與6 h組、2 h與12 h組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為 P＞0.05)，推測 MMP-2的分泌隨時間而降低。凝血酶組各時間點(diǎn)間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但均數(shù)比較，呈上升趨勢。水蛭組2 h時MMP-2的分泌高于6 h、12 h，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)，6 h、12 h間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，均數(shù)呈下降趨勢。合藥組各時間點(diǎn)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05)，均值呈上升趨勢(圖1)。

Figure 1 Histogram of OD value of MMP-2 in each group 各組MMP-2 OD值比較柱狀圖

2.2 IV型膠原檢測結(jié)果 由表2可知，在同一時間點(diǎn)上，不同組間IV型膠原的含量不同。正常培養(yǎng)狀態(tài)下，2 h時空白組IV型膠原的含量高于凝血酶組、合藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為 P＜0.05)，空白組與水蛭組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，凝血酶組、水蛭組、合藥組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05)。6 h時水蛭組IV型膠原的含量明顯高于其他3組，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)，凝血酶組、合藥組、空白組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。12 h時空白組IV型膠原的含量明顯高于合藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);水蛭組IV型膠原的含量明顯高于凝血酶組及合藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而凝血酶與合藥組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 同一時間點(diǎn)各組IV型膠原含量Table 2 Type IV collagen contents in each group at same time point (ˉx±s，n=6，ρ/ng·mL－1)

空白組2 h、12 h IV型膠原的含量均較6 h高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為 P ＜0.05)，2 h、12 h間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。凝血酶組IV型膠原的合成呈增加趨勢，12 h與2 h相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);6 h時IV型膠原的含量處于兩者之間，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為 P＞0.05)。水蛭組IV型膠原的合成呈明顯增加，6 h、12 h時IV型膠原的含量顯著高于2 h時，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05);6 h、12 h之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。合藥組在3個時間點(diǎn)上IV型膠原的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見圖2)。

Figure 2 Histogram of type IV collagen contents in each group 各組IV型膠原含量比較柱狀圖

3 討論

ECM是組成間質(zhì)和上皮-血管中基質(zhì)的不溶性結(jié)構(gòu)成份，包括各型膠原、蛋白多糖、糖蛋白和彈性蛋白等。ECM是一種活躍的動態(tài)物質(zhì)，影響細(xì)胞的分化、增殖、黏附、形態(tài)發(fā)生和表型表達(dá)等生物學(xué)過程。另外，ECM還存在一些可溶性成份，主要有與基質(zhì)代謝相關(guān)的蛋白酶和與基質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞因子。

血管內(nèi)皮細(xì)胞受病理性原因的刺激，向血管形成刺激物方向遷移、增殖過程中，內(nèi)皮細(xì)胞周圍的ECM必須有選擇性地降解，控制這一活動的酶就是MMPs。MMPs主要作用是降解膠原等ECM，金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)是MMP的特異性抑制劑，MMP與TIMP的平衡維持著體內(nèi)ECM合成與降解的平衡，是維持組織器官正常結(jié)構(gòu)和生理功能的關(guān)鍵，MMP與TIMP之間平衡的破壞是新生血管產(chǎn)生的重要原因。

目前在眼底新生血管性疾病中，對MMPs的研究在不斷深入，證明了MMPs與眼部新生血管的形成有密切關(guān)系［9-11］。血管內(nèi)皮細(xì)胞能分泌多種 MMPs，眼部新生血管性疾病中研究最多的是 MMP-2、MMP-9［12-17］。本實(shí)驗(yàn)任意選擇了其中的MMP-2作為研究點(diǎn)，探討了水蛭提取液對MMP-2分泌的作用。

本研究結(jié)果顯示，細(xì)胞在不同的生長環(huán)境中MMP-2分泌不同?？瞻捉M2 h即有MMP-2的分泌，12 h時各組間 MMP-2的含量出現(xiàn)差異，空白組、水蛭組的MMP-2表達(dá)低于凝血酶組，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為 P＜0.05)，合藥組與空白組、水蛭組、凝血酶組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為 P＞0.05)，但合藥組的 MMP-2含量的均數(shù)較凝血酶組降低，說明水蛭降低了凝血酶促進(jìn)MMP-2分泌的作用;合藥組均數(shù)6 h、12 h時較水蛭組高，也進(jìn)一步證明了凝血酶有促進(jìn)細(xì)胞分泌MMP-2的作用，與文獻(xiàn)報(bào)道相符［18］。

從各組縱向觀察，雖各時間點(diǎn)間無顯著性差異，但由均數(shù)看，正常組細(xì)胞分泌的MMP-2隨時間延長呈輕度下降趨勢，12 h時明顯降低。水蛭組細(xì)胞分泌的MMP-2亦呈下降狀，水蛭有降低MMP-2分泌的作用。凝血酶組細(xì)胞分泌的MMP-2呈上升趨勢。合藥組MMP-2分泌量，與水蛭組、凝血酶組的縱向變化相比，合藥組MMP-2的分泌要處于兩者中間的走向趨勢，推測水蛭提取液對凝血酶促M(fèi)MP-2的分泌有抑制作用。

血管生成中膠原的合成與聚集起重要作用，IV型膠原有促進(jìn)細(xì)胞黏附、遷移、分化、生長的作用，在腫瘤血管生成中作用很關(guān)鍵［19］。IV型膠原是ECM的主要成分之一。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 h時空白組IV型膠原的含量較高。6 h時、12 h時水蛭組IV型膠原的含量較高。縱觀3個時間點(diǎn)，空白組IV型膠原的含量相對穩(wěn)定，凝血酶組、水蛭組、合藥組IV型膠原的合成均有增加趨勢，水蛭組的增加幅度明顯。

研究已證實(shí)，凝血酶具有促進(jìn)MMPs分泌增加及ECM、基底膜降解的作用，控制降解的酶是MMPs［20］，但 MMPs 的成員較多，ECM、基底膜降解是多種因素共同作用的結(jié)果，如 MT1-MMP［21］、MMP-9［22］等。

本研究結(jié)果提示了64 g·L－1水蛭提取液可以降低體外培養(yǎng)條件下ECM中MMP-2的含量，并隨作用時間的增加，有促進(jìn)下降的趨勢;凝血酶組隨著作用時間的增加，有促進(jìn)MMP-2分泌增加的趨勢;64 g·L－1水蛭提取液有抵制凝血酶促進(jìn) MMP-2分泌的作用;同時64 g·L－1水蛭提取液可以促進(jìn)體外培養(yǎng)下ECM中IV型膠原的合成，并隨作用時間的持續(xù)，有促進(jìn)合成增加的趨勢，從而抑制了ECM的降解;凝血酶組隨著作用時間的增加，有輕度促 IV型膠原的合成增加的趨勢，但與空白組相比，有降低IV型膠原的合成，促進(jìn) ECM降解的作用;2 h時64 g·L－1水蛭提取液有降低凝血酶促進(jìn)ECM降解的作用。由此我們提出64 g·L－1水蛭提取液促進(jìn)了在體外培養(yǎng)條件中凝血酶誘導(dǎo)下細(xì)胞微環(huán)境中IV型膠原的合成，抑制了MMP-2的分泌，改變了細(xì)胞生長的微環(huán)境，對新生血管的形成有抑制作用，但其機(jī)理尚不完全清楚，有待進(jìn)一步的研究。

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