梁婷 范明 馬蘭茗 隋曉紅

脈絡(luò)膜上腔跨視網(wǎng)膜電刺激是近年來提出的一種新型的視網(wǎng)膜視覺假體，相比之前的兩種視網(wǎng)膜視覺假體(視網(wǎng)膜上視覺假體和視網(wǎng)膜下視覺假體)來講，該假體具有很多優(yōu)勢，如:避免了電極與視網(wǎng)膜直接接觸帶來的損傷，電極容易在體內(nèi)長期固定等等。在過去的幾年中，該領(lǐng)域內(nèi)的研究證明了這種新興假體的可行性［1-4］，有關(guān)假體的刺激參數(shù)的研究還相對較少［5］。由于刺激參數(shù)直接決定了假體的安全性和有效性，因此我們對實際應(yīng)用中所涉及的各種刺激參數(shù)進行了系統(tǒng)研究(脈沖寬度、刺激頻率以及脈沖波形)，獲得的實驗結(jié)果一方面可以用來指導(dǎo)假體刺激器的設(shè)計，另一方面可以輔助實際應(yīng)用中選擇安全有效的電刺激方案。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年白兔15只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg(上海交通大學(xué)激光與光子醫(yī)學(xué)生物研究所提供)。所有操作過程符合眼及視力研究協(xié)會的實驗動物使用規(guī)定。

1.2 刺激電極 實驗采用的薄膜電極(圖1)由中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所提供，刺激點的材料為鉑金。

1.3 手術(shù)過程 白兔耳緣靜脈注射30 g·L－1異戊巴比妥鈉1 mL·kg－1誘導(dǎo)動物麻醉，將動物固定于手術(shù)臺上。每0.5 h靜脈給予30 g·L－1異戊巴比妥鈉0.3 mL維持麻醉狀態(tài)。美多麗散瞳劑(復(fù)方托吡卡胺滴眼液)滴眼，散大雙眼瞳孔。手術(shù)顯微鏡下開瞼器撐開眼瞼，環(huán)形剪開下方球結(jié)膜，分離并剪斷下直肌。角鞏膜緣后10 mm與角鞏膜緣平行切開鞏膜3 mm，暴露脈絡(luò)膜。將薄膜電極輕柔地順著鞏膜切口植入脈絡(luò)膜上腔，刺激點部位到達眼球后極部，視盤正下方。5-0線將薄膜電極固定于鞏膜上。常規(guī)眼底檢查，確定電極植入位置，檢查是否有脈絡(luò)膜脫離及出血等并發(fā)癥。

Figure 1 Photograph of electrode array.The 3 ×4 electrode array consisted of platinum monopolar planar electrodes of 50 μm，150 μm，350 μm，and 500 μm diameter mounted on a 30 μm thick polyimide strip 聚酰亞胺薄膜電極。薄膜電極帶有3×4的12電極陣列，包含有直徑50 μm、150 μm、350 μm、500 μm 的四種尺寸的刺激點

1.4 皮層信號的記錄 切開頭部皮膚，分離皮下組織，暴露顱骨。根據(jù)白兔視網(wǎng)膜與視皮層的投射對應(yīng)關(guān)系，于植入眼的對側(cè)視皮層相應(yīng)的區(qū)域內(nèi)(距垂直中線約 4 mm、Bregma點后 11 mm，大小約 5.00 mm×5.00 mm)記錄電刺激誘發(fā)的響應(yīng)。該區(qū)域內(nèi)鉆3×3(9)個孔，將不銹鋼螺釘擰入孔中，末端與硬腦膜接觸，作為記錄電極。在植入眼同側(cè)的視皮層相應(yīng)位置(Bregma點前6 mm、中線旁4 mm處)，鉆入不銹鋼螺釘作為參考電極。不銹鋼針插入兔耳皮下作為地電極。采用多通道電生理記錄系統(tǒng)(System 3，Tucker-Davis Technologies，Alachua，F(xiàn)L，USA)，帶通頻率為3～500 Hz，記錄到的結(jié)果為50個皮層反應(yīng)疊加后的平均結(jié)果。

1.5 刺激閾值的測定 實驗中采用電荷平衡的雙相脈沖進行電刺激，脈沖寬度分別為0.25 ms、0.50 ms、0.75 ms、1.00 ms、刺激頻率為 1 Hz、2 Hz、4 Hz。首先給以閾下刺激，逐步增加刺激強度，直到一個穩(wěn)定、確切的皮層響應(yīng)電誘發(fā)電位(electrical evoked potential，EEP)出現(xiàn)，我們將這個最小的電流強度確定為閾電流。閾電流乘以脈沖脈寬，則得到閾電荷。將閾電荷除以刺激電極的面積，則得到相應(yīng)的閾電荷密度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 同一動物體內(nèi)獲得的結(jié)果，采用配對t檢驗進行比較;不同的動物體內(nèi)獲得的結(jié)果采用方差分析進行比較(ANOVA)。所有的統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 13.0軟件完成。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

實驗中采用直徑為50 μm的刺激點進行電刺激，刺激頻率為1 Hz，脈沖寬度分別為 0.25 ms和1.00 ms時，誘發(fā)EEP所需的閾電荷密度分別為1.0 mC·cm－2和 2.1 mC·cm－2，電極表面發(fā)生了明顯的腐蝕，其他尺寸的電極未發(fā)生損壞。

2.1 皮層的響應(yīng) 皮層記錄到的EEP波形和視覺誘發(fā)的反應(yīng)(visual voked potential，VEP)的波形相類似，但潛伏期存在著顯著的差異。VEP的潛伏期為(24.7±2.2)ms(n=5)，EEP 的潛伏期為(13.1±1.9)ms(n=5)，明顯短于VEP的潛伏期(P＜0.05;圖2)。

2.2 刺激頻率對于EEP幅度的影響 刺激強度不變，隨著刺激頻率的增加，EEP的幅度逐漸下降。我們將1 Hz時EEP的幅度作為1，其他頻率下獲得的EEP的幅度與其相比求得相對的幅度。結(jié)果顯示:1 Hz時EEP幅度為 1.00±0.00;2 Hz時幅度降低到為0.61±0.03;4 Hz時幅度為 0.36±0.07;當(dāng)刺激頻率達到6 Hz時，EEP幅度降低為1 Hz時的12%，為0.12±0.06。并且隨著刺激頻率的增加，EEP的潛伏期也隨之延長。從1 Hz時的(14.4±2.8)ms增加到6 Hz的(17.72±1.1)ms。當(dāng)刺激頻率增加到8 Hz時，沒有記錄到EEP。

Figure 2 Waveform of VEP(a)and EEP(b)recorded at visual cortex.VEP:The flash power of the photic stimulator was 90 mJ with frequency of 1 Hz;EEP:Stimulus current was a biphasic current pulse with anodic-or cathodic-first stimulation at the pulse durations(stimulus amplitude was 200 μA，pulse duration was 0.5 ms and stimulus frequency was 1 Hz) 在兔的視皮層記錄到的VEP(a)和EEP(b)的波形。VEP:刺激的能量為90 mJ，頻率為1 Hz;EEP:刺激波形為先負后正的電荷平衡的雙相脈沖，幅度200 μA、脈沖寬度0.5 ms，刺激頻率 1 Hz

2.3 不同的刺激頻率下電極尺寸對閾電流強度的影響 無論在哪一刺激頻率下，500 μm電極和350 μm電極誘發(fā)皮層響應(yīng)所需的閾電流大小之間無明顯差異(P＞0.05，圖3)。在低頻脈沖刺激下(1 Hz)小電極(150 μm)誘發(fā)EEP所需的電流強度比大電極(350 μm、500 μm)低(P＜0.05，圖 3);隨著刺激頻率的增加，誘發(fā)EEP所需的閾電流強度也隨之增加，當(dāng)刺激頻率為2 Hz時，三種尺寸的電極之間的閾電流無明顯差異(P＞0.05)。當(dāng)刺激頻率增加為4 Hz時，盡管三者所需的閾電流之間差異依然無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，但此時150 μm電極所需的閾電流要略高于大電極(500 μm、350 μm)所需的閾電流(圖3)。

Figure 3 Effects of electrode size on threshold current 電極尺寸對閾電流強度的影響

2.4 電極尺寸、脈沖寬度和刺激頻率共同對于閾電流的影響 整體上誘發(fā)皮層響應(yīng)所需的閾電流均隨著脈沖寬度的增加而減小，隨著刺激頻率的增加而增加(圖3)。無論采用哪種尺寸的電極進行刺激，在4 Hz下獲得的閾電流的大小總是高于1 Hz時所需的閾電流(P＜0.05)，這種增加的比率在短脈沖寬度(0.25 ms)刺激時為77%(500 μm 電極)和170%(150 μm 電極);在長脈沖寬度(1.0 ms)刺激時，增加的比率較低，約為38%(500 μm電極)和131%(150 μm 電極)。

2.5 刺激波形對于閾電流的影響 采用先負后正及先正后負兩種刺激脈沖進行電刺激，先負后正的刺激脈沖誘發(fā)EEP所需的閾電流總是低于先正后負的刺激脈沖所需的閾電流(P＜0.05，圖4)。

Figure 4 Effects of stimulus waveforms on threshold current(*statistical differences).Pulse duration was 0.25 ms and stimulus frequency was 1 Hz 刺激波形對于閾電流的影響(*表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義)。脈沖跨度為0.25 ms，刺激頻率為1 Hz

3 討論

3.1 與其他實驗結(jié)果的比較 本實驗誘發(fā)EEP所需的閾值與其他研究小組獲得的結(jié)果相接近［4］。Sakaguchi等［3］使用直徑 100 μm 的電極、0.5 ms 的脈沖寬度在脈絡(luò)膜上腔對視網(wǎng)膜進行電刺激時，所需的閾電流大小為66 μA。而我們研究中采用的直徑150 μm電極、0.5 ms的脈沖寬度進行刺激時，閾電流大小為50.8 μA，兩者非常接近。對于電極尺寸與閾電流之間的關(guān)系，我們獲得的結(jié)果并未如期待的那樣:大電極需要的閾值高，小電極需要的閾值低。研究發(fā)現(xiàn)500 μm和350 μm電極誘發(fā) EEP所需的閾電流強度沒有明顯的差異，這可能是電極與視網(wǎng)膜神經(jīng)元之間的距離導(dǎo)致的。有研究表明在視網(wǎng)膜表面進行電刺激時，大電極誘發(fā)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞興奮所需的閾值高，小電極所需的閾值低。隨著電極不斷的遠離視網(wǎng)膜表面，大電極與小電極之間的差異消失［6］。同時在 Chowdhury 等［7］和 de Balthasar等［8］的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，當(dāng)電極距離視網(wǎng)膜一定位置時，電極尺寸與閾電流的大小無關(guān)。在我們的研究中，電極植入的位置位于脈絡(luò)膜上腔，電極與視網(wǎng)膜之間也存在著一定的距離，可能是這一距離消除了500 μm電極和350 μm電極之間的差異。

3.2 電極尺寸的選擇 實驗中采用直徑為50 μm的電極進行刺激時，誘發(fā)EEP相應(yīng)的閾電荷密度，顯然高于鉑電極所能承受的最大電荷密度0.35 mC·cm－2，因此電極發(fā)生了損壞［9-10］。這可能與電極過小有關(guān)，由于過小的電極誘發(fā)神經(jīng)元活動的數(shù)量較少，為了獲得一個可觀察到的皮層反應(yīng)，勢必需要增大刺激強度。此外，由于電極植入的位置相對于視網(wǎng)膜上和視網(wǎng)膜下電極來說，距離視網(wǎng)膜內(nèi)神經(jīng)元位置相對較遠，加之視網(wǎng)膜色素上皮層附加的阻抗較高［11］，因此誘發(fā) EEP 所需的刺激閾值較高［12］。由此可見對于STS視覺假體來說，使用過小尺寸的電極是不安全的。目前人們正在使用各種電化學(xué)技術(shù)對電極的表面進行加工修飾，使其光滑的表面變得粗糙，增加電極實際的使用面積，從而降低電荷密度，達到避免電極和組織損傷的目的［13-15］。

3.3 刺激參數(shù)最優(yōu)組合 研究中發(fā)現(xiàn)，高頻刺激時小電極(150 μm)比大電極(500 μm)需要更大的刺激強度，并且當(dāng)刺激頻率達到一定高度時，加大刺激強度也未能引出皮層的響應(yīng)，這可能是由于反復(fù)地電刺激導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性下降的結(jié)果，尤其是小電極更為明顯。與此同時，大電極伴隨長脈沖寬度刺激時，刺激強度隨著刺激頻率增加的幅度最小，此時也可能對神經(jīng)元興奮性的影響最小。因此大電極伴以長脈沖寬度可能是未來STS視覺假體實際應(yīng)用中優(yōu)先選擇的刺激方案。此外由于先負后正的刺激脈沖所需的閾電流較低，因此這也將成為未來優(yōu)先選擇的刺激波形。

本實驗采用脈絡(luò)膜上腔跨視網(wǎng)膜電刺激的方式，對電刺激中各種參數(shù)進行了系統(tǒng)地研究，盡管研究結(jié)果揭示了刺激參數(shù)的優(yōu)化的組合方式，但是具體參數(shù)的選擇將會產(chǎn)生怎樣的視覺感覺依然不十分清楚，這就需要我們進一步了解這種電刺激潛在的神經(jīng)機制，因為只有真正地認識這種人工裝置才能更好地為盲人提供完美的視覺。

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