王清 郭喬茜 李琴 謝婷玉 陳雪藝

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是在氧化應激、炎癥反應等［1］條件下產生的視網膜細胞因子改變、細胞凋亡、微血管損傷的一種血管性疾病。臨床上尚無早期的預防措施。

臭氧治療被證明可以作用于機體，影響血流變，改善供氧，抑制機體炎癥反應、氧化應激反應，從而對相關疾病發(fā)揮作用［2］。研究表明臭氧治療對糖尿病大鼠血管平滑肌和內皮細胞有保護作用，可延緩糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)展［3］，但臭氧治療能否影響DR發(fā)展尚無報道。本研究通過建立糖尿病大鼠模型，觀察臭氧治療對糖尿病大鼠視網膜細胞凋亡及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)在視網膜表達的影響，對其作用機制進行探討，為臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康清潔級雄性 SD大鼠72只(新疆醫(yī)科大學動物中心提供)，鼠齡12～16周，體質量270～300 g。實驗動物的使用均遵循國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。并通過新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查。

1.1.2 主要試劑及儀器 高脂高糖飼料(新疆醫(yī)科大學動物中心提供);體積分數10%臭氧混合氣(臭氧與氧氣混合，由德國HERRMANN臭氧發(fā)生儀制備);鏈脲佐菌素(streptozotoein，STZ;美國 Sigma公司);SumStep血糖儀(美國強生公司);石蠟切片機(瑞典);TUNEL凋亡試劑盒(瑞士羅氏);光學顯微鏡(瑞典Leica DM3000);Trizol、反轉錄試劑盒(美國Thermo公司);RT-PCR儀(美國BIO-RAD CFX96);SYBR Green real-time PCR試劑盒 (德國 Qiagen公司);VEGF上游引物:5’-AGAAAGCCCAATGAAGTGGTG-3’，下游引物:5’-ACTCCAGGGCTTCATCATTG-3’;PEDF 上 游 引 物:5’-AGAAAGCCCAATGAAGTGGTG-3’，下游引物:5’-ACTCCAGGGCTTCATCATTG-3’;β-actin 上游引物:5’-ACTGCCCTGGCTCCTAGCA-3’，下 游 引 物:5’-GCCAGGATAGAGCCACCAATC-3’(上海生工合成)。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的建立、分組及處理 72只大鼠適應性喂養(yǎng)1個月后，隨機數字表法選出正常對照組(N組)大鼠18只，普通飼料喂養(yǎng)。其他54只用于糖尿病大鼠造模，高脂高糖飼料喂養(yǎng)45 d，禁食不禁水12 h后，用無菌的新鮮配制的0.1 mmol·L－1、pH 4.3～ 4.5 檸檬酸鹽緩沖液稀釋的 STZ(10 g·L－1)，按 30 mg·kg－1體質量一次性腹腔注射誘導糖尿病大鼠模型。注射24 h后，斷尾法取血測血糖，兩次血糖平均值≥16.7 mmol·L－1視為達標，不達標大鼠重復注射一次，兩次不達標者被剔除，最終52只SD大鼠造模成功(成模率90%)。

造模1個月后，造模成功的大鼠隨機分為3組:糖尿病模型對照組(D組，17只):不給予任何干預;氧氣干預對照組(D+O2組，17只):氧氣灌腸作為對照;臭氧治療組(D+O3組，18只):臭氧混合氣灌腸。臭氧治療以1個月為1個療程，每周3次。臭氧發(fā)生儀制備臭氧混合氣。大鼠排空直腸后，臭氧混合氣緩慢灌入。按壓肛門5 min，防止氣體泄出。氧氣灌腸方法同臭氧灌腸，氣體體積換算至與臭氧等量。

1.2.2 取材 臭氧治療1個療程后，各組取7只大鼠腹腔注射麻醉后均摘除左側眼球置于冰上，顯微鏡下沿角鞏膜緣剪開，去除眼前節(jié)及玻璃體呈杯狀置40 g·L－1多聚甲醛中固定48 h，用于細胞凋亡制片。剩余大鼠麻醉后摘除眼球去除眼前節(jié)，快速剝離雙側視網膜組織后置于一個凍存管中，液氮冷凍10 min后－80°保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 視網膜細胞凋亡檢測 TUNEL法檢測視網膜細胞凋亡，標本常規(guī)逐級脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，沿視神經走行方向縱向連續(xù)切片，切片厚4 μm。石蠟切片常規(guī)脫臘至水化，體積分數3%H2O2室溫處理 10 min;加入0.01 mol·L－1枸櫞酸溶液微波修復10 min，室溫冷卻;滴加TUNEL MIX(TUNEL標記液與TUNEL酶按1∶30稀釋)，37℃濕盒內孵育60 min;滴加TUNEL過氧化物酶轉化劑，37℃濕盒內孵育30 min;新鮮配制的DAB顯色液顯色，蘇木素輕度復染，水洗、脫水、透明、封片;光學顯微鏡觀察、攝片。計算凋亡指數(apoptotic index，AI):每張切片高倍鏡下計數至少500個細胞，每100個細胞的棕色陽性細胞數，用百分數表示即細胞AI。

1.2.4 VEGF mRNA、PEDF mRNA 表達量的檢測

取大鼠視網膜組織，液氮中研磨后加入1 mL Trizol，按照說明書步驟行 Trizol一步法提取總 RNA?？俁NA反轉錄為cDNA，于－20℃保存。PCR反應體系為 20 μL:cDNA 2.0 μL、上下游引物各 0.3 μL、25 ×SYBR Green MIX 10 μL、去離子水 7.4 μL。以cDNA為模板行PCR擴增后，分別將VEGF、PEDF和β-actin的PCR產物純化后10倍梯度稀釋5～8個濃度梯度，作為模板行熒光定量PCR擴增，建立標準曲線。反應條件為預變性95.0℃ 3 min;變性95.0℃ 10 s;退火 30 s，VEGF、PEDF、β-actin 退火溫度分別為61.7℃、68.4℃和62.6℃，分別持續(xù)40個循環(huán)，每個循環(huán)后采集熒光生成擴增曲線。擴增結束后65.0～95.0℃按0.5℃增值進行溶解曲線分析。每一樣品VEGF、PEDF和β-actin的檢測均做2個平行管。VEGF和PEDF與β-actin表達的比值為視網膜VEGF mRNA和PEDF mRNA的表達量。實驗重復3次，取各組平均值用于結果分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，數據以均數±標準差()表示。各組大鼠視網膜細胞AI、VEGF mRNA和PEDF mRNA的表達采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組視網膜細胞凋亡結果比較 凋亡細胞的特點是細胞核呈棕色，細胞體積較正常細胞稍小。4組大鼠視網膜切片TUNEL法染色均可看到凋亡細胞陽性表達，N組內核層偶見散在凋亡細胞，D組、D+O2組、D+O3組凋亡細胞表達量較多，主要表達在視網膜神經節(jié)細胞層及內核層，外核層偶見表達，同時血管內皮細胞處亦可見表達較多(圖1)。N組、D 組、D+O2組、D+O3組 AI值分別為 1.97±0.53、34.43±5.56、34.68±5.80、19.22±3.30，各組間AI差異有統(tǒng)計學意義(F=89.070，P=0.000)。進一步兩兩比較結果顯示:N組與D組、D+O2組、D+O3組比較差異均有統(tǒng)計學意義(均為P=0.000);D+O3與D組、D+O2組比較差異均有統(tǒng)計學意義(均為P=0.000);D組與D+O2組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.913)。

2.2 各組視網膜VEGF mRNA、PEDF mRNA表達比較 RT-PCR法檢測結果顯示，溶解主峰單一表示擴增特異性好。VEGF、PEDF和β-actin溶解溫度分別為84.5℃、83.5℃、82.0℃。擴增效率數值為95～100，相關性均接近1，斜率接近－3.3，表明可信度高。

大鼠視網膜中VEGF mRNA的相對表達量:N組、D 組、D+O2組、D+O3組分別為 4.22±1.18、11.60±3.42、10.75±2.81、7.40±2.13，各組間差異有統(tǒng)計學意義(F=23.923，P=0.000)。進一步兩兩比較結果顯示:D組、D+O2組、D+O3組大鼠視網膜中VEGF mRNA的表達量均明顯高于N組，差異均有統(tǒng)計學意義(均為 P=0.000);D+O3組VEGF mRNA的表達量低于D組和D+O2組，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P=0.000);D組與D+O2組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.386)。

大鼠視網膜中PEDF mRNA的表達量:N組、D組、D+O2組、D+O3組分別為 0.22±0.12、0.13±0.08、0.12±0.07、0.19±0.09，各組間差異無統(tǒng)計學意義(F=2.803，P=0.053)。進一步兩兩比較結果顯示:N組與D組、D+O2組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.018、P=0.029)，與 D+O3組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.397);D+O3組表達量高于D組和D+O2組，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.058，P=0.066);D組與 D+O2組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.840)。

Figure 1 Retinal apoptosis cell detected by TUNEL technique(DAB ×400).A:Group N;B:Group D;C:Group D+O2;D:Group D+O3 TUNEL法檢測視網膜細胞凋亡(DAB，×400):A:N組;B:D組;C:D+O2組;D:D+O3組

3 討論

本研究著重于DR早期病變，使用SD大鼠高脂高糖喂養(yǎng)聯(lián)合STZ腹腔注射方法造模，本次造模成功率96%。在DR發(fā)病過程中，高糖環(huán)境下引起的視網膜炎癥反應發(fā)揮著關鍵作用，尤其在DR早期，代謝通路異常使視網膜細胞功能喪失而發(fā)生凋亡，進一步導致代謝紊亂，毛細血管變性、閉塞，繼而出現(xiàn)視網膜組織缺氧，發(fā)生氧化應激損傷，促新生血管因子表達，新生血管形成［1，4］。由于臭氧治療被證明在合適濃度下作用于機體可以發(fā)揮抗炎、改善供氧、防止氧化應激等治療作用。本實驗采用相對安全的臭氧灌腸治療法治療DR，效果理想［5］。

視網膜細胞凋亡是糖尿病開始出現(xiàn)的早期癥狀之一［6］。本實驗中 TUNEL法檢測視網膜細胞凋亡結果表明，D組、D+O2組、D+O3組大鼠視網膜組織中可見大量凋亡細胞，主要分布在神經節(jié)細胞層和內核層，這與董志軍等［7］研究一致。糖尿病的高糖環(huán)境引起視網膜代謝功能紊亂，刺激視網膜促炎因子表達量增高，早期氧化應激反應激活多種代謝通路，破壞線粒體電子傳遞鏈功能，促使凋亡的發(fā)生［4，8］。本研究結果表明，D+O3組的 AI明顯低于D組和 D+O2組(均為 P=0.000)。臭氧可發(fā)揮抗炎、抗氧化應激作用，當臭氧直腸灌注被腸壁黏膜吸收后，可通過調控炎癥因子［9］、炎癥介質及細胞因子表達減輕炎癥損傷，引起全身輕度的氧化應激，激活機體抗氧化保護系統(tǒng)，保護細胞免受氧化和炎癥反應刺激，同時可能逆轉慢性氧化應激［2，10］。

本實驗RT-PCR方法檢測結果顯示:D組、D+O2組、D+O3組大鼠視網膜VEGF mRNA的表達量明顯高于 N組(均為 P=0.000)。VEGF是最直接的眼內新生血管形成因子，相對缺氧會促進 VEGF的分泌。本實驗結果示，D+O3組 VEGF mRNA表達量在糖尿病發(fā)病早期即高于N組，但明顯低于D組和D+O2組，說明D+O3組大鼠視網膜的相對缺氧狀態(tài)得到改善。因為糖尿病會導致血液黏稠度增高，血管內皮損傷，臭氧可以增加脂質代謝酶活性，參與體內脂質的代謝，降低血脂［11］;同時，臭氧與機體作用還能夠發(fā)揮擴張血管等藥理作用，促進毛細血管開放，改善血液流變學［12］，提高三磷酸腺苷和2，3-磷酸甘油水平，并能降低氧合血紅蛋白結合力，促進氧氣的釋放，增加血液攜帶氧量，改善糖尿病早期視網膜的供氧狀態(tài)，從而相對減少VEGF的分泌量［13］。

PEDF作為一種多功能蛋白，有明顯的神經營養(yǎng)、抗血管生成、抗血管通透、抗炎作用，越來越多的證據證明它對DR有保護作用。強烈的氧化應激是使 PEDF減少的原因之一［14］。本研究結果顯示，D組和D+O2組PEDF mRNA表達量低于N組(均為P ＜0.05)和 D+O3組(均為 P ＞0.05)。通過變化趨勢的觀察發(fā)現(xiàn)，PEDF表達量隨VEGF的升高而降低，這與吳晉暉等［15］的研究結果一致。由此我們推測，臭氧通過其抗氧化應激作用以及VEGF的抑制作用，可能對PEDF起保護作用，但這一推測仍需要更科學的實驗驗證。

綜上所述，臭氧治療作為一種新的治療方法，可能在作用于全身的同時，抑制視網膜的炎癥、氧化應激反應，改善視網膜供氧，從而延緩DR的發(fā)展。需要特別說明的是，臭氧使用時應避免呼吸道吸入，蠶豆病患者不能進行臭氧治療，臭氧治療還可能會引發(fā)極少的過敏反應。本研究也存在不足之處，臭氧灌腸的方法雖然容易操作，但對于劑量的控制性稍差。臭氧治療干預時間較短，長期治療效果需要繼續(xù)深入研究。臭氧治療能否作為一種臨床可用的預防DR的治療方法仍需要更多的研究和實踐來證實。

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