李云 劉菲

隨著糖尿病發(fā)病率的上升及病程的延長(zhǎng)，糖尿病患者發(fā)生各種慢性并發(fā)癥日益增多。糖尿病性白內(nèi)障已成為糖尿病并發(fā)癥中僅次于視網(wǎng)膜病變的第二大眼?。?］，是導(dǎo)致糖尿病患者視力下降甚至失明的重要原因［2］。研究發(fā)現(xiàn)，晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells，LEC)凋亡可能是各種非先天性白內(nèi)障的共同細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，而Cyt C及Caspase 3在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)建立糖尿病動(dòng)物模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和Western blot技術(shù)檢測(cè)LEC中Cyt C及Caspase 3的表達(dá)情況，為糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑 60只 SD大鼠購(gòu)自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)部，均為雄性，體質(zhì)量(180±10)g。鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自美國(guó) Sigma公司;Cyt C抗體、Caspase 3(Ab-150)抗體及生物素標(biāo)記兔抗大鼠IgG購(gòu)自Anbobio公司;免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;線粒體提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Keygen公司。

1.1.2 主要儀器 德國(guó)羅氏公司卓越型血糖儀，美國(guó)Biorad公司ChemiDoc-It化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)及垂直電泳儀，德國(guó) Eppendorf低溫超速離心機(jī)，日本奧林巴斯倒置光學(xué)顯微鏡、裂隙燈眼前段照相系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將60只8周齡健康 SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組各30只。

1.2.2 動(dòng)物模型制作 實(shí)驗(yàn)組:大鼠禁食12 h，一次性腹腔注射 20 g·L－1STZ溶液(臨用時(shí)用0.1 mol·L－1、pH 4.5 檸檬酸緩沖液配制，在 30 min 內(nèi)注射完畢)，劑量為60 mg·kg－1，3 d后在大鼠尾靜脈采血檢測(cè)血糖濃度，空腹血糖達(dá)到16.7 mmol·L－1為糖尿病大鼠。不達(dá)標(biāo)者待血糖恢復(fù)至正常后再常規(guī)劑量注射。若出現(xiàn)死鼠則需按樣本量補(bǔ)足。對(duì)照組:給予腹腔注射等量 0.1 mol·L－1、pH 4.5 檸檬酸緩沖液。

1.2.3 觀測(cè)指標(biāo) 造模后每4周取大鼠尾靜脈血檢測(cè)2組大鼠的空腹血糖濃度，并用裂隙燈觀察2組大鼠晶狀體的混濁情況。12周末，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取10只大鼠(共20眼)，取晶狀體前囊膜行免疫組織化學(xué)染色;另對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取10只大鼠(共 20眼)，取晶狀體前囊膜行 Western blot檢測(cè)胞漿及線粒體內(nèi)Cyt C的表達(dá);剩余10只大鼠(共20眼)取晶狀體前囊膜行Western blot檢測(cè)Caspase 3的表達(dá)。

1.2.4 方法

1.2.4.1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè) Cyt C、Caspase 3的表達(dá) 12周末頸椎脫臼法處死大鼠，完整取出雙眼球后娩出晶狀體，用顯微無齒鑷撕取晶狀體前囊膜，立即放入體積分?jǐn)?shù)4%甲醛液中固定24～48 h，制成4 μm厚石蠟切片，應(yīng)用免疫組織化學(xué)三步法檢測(cè)LEC中Cyt C、Caspase 3的表達(dá)。一抗?jié)舛染鶠?∶150，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.4.2 Western blot檢測(cè)Cyt C 的表達(dá) 將晶狀體前囊膜組織剪成細(xì)小碎片，按線粒體提取試劑盒說明書制備線粒體蛋白樣品與胞漿蛋白樣品，BCA法測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳完畢后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，50 g·L－1脫脂奶粉封閉，用Cyt C抗體作用過夜，PBS液洗脫后與兔抗鼠IgG-過氧化物酶二抗結(jié)合，洗膜，ChemiDoc-It化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)顯影成像。

1.2.4.3 Western blot檢測(cè) Caspase 3 的表達(dá) 晶狀體前囊膜組織碾磨成粉末，蛋白裂解液充分裂解后加入蛋白抽提劑，在4℃、12 000 r·min－1下離心10 min，保留蛋白膜，滴加1 mL純乙醇后，在12 000 r·min－1、4 ℃條件下離心 3 min，制備蛋白樣品，應(yīng)用BCA法測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳，電泳完畢后蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，50 g·L－1脫脂奶粉封閉，用 Caspase 3抗體作用過夜，PBS液洗脫后與兔抗鼠IgG-過氧化物酶二抗結(jié)合，洗膜，Chemi-Doc-It化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)顯影成像。

1.3 結(jié)果判斷 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):胞漿中呈現(xiàn)棕黃色均勻著色，表明Caspase 3及Cyt C染色陽性。Western blot定量分析通過Quantity One軟件測(cè)定灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩樣本均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)資料的統(tǒng)計(jì)分析采用單變量方差分析(ANOVA法)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)的兩兩比較采用 Bonferroni分析進(jìn)行。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血糖監(jiān)測(cè)結(jié)果 大鼠模型制作3 d后，實(shí)驗(yàn)組大鼠空腹血糖為(22.24±2.50)mmol·L－1，達(dá)到成模標(biāo)準(zhǔn)，至 12周末空腹血糖為(24.04±2.40)mmol·L－1，在實(shí)驗(yàn)過程中無明顯波動(dòng)。對(duì)照組大鼠血糖實(shí)驗(yàn)開始時(shí)為(5.13±0.52)mmol·L－1，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)為(5.13±0.37)mmol·L－1，波動(dòng)始終處于正常水平。

2.2 裂隙燈檢查結(jié)果 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，可觀察到實(shí)驗(yàn)組大鼠晶狀體出現(xiàn)混濁(圖1)，對(duì)照組大鼠晶狀體均透明(圖2)。

2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組大鼠晶狀體囊膜中Cyt C和Caspase 3呈陽性表達(dá)(圖3-圖4)，但是在對(duì)照組表達(dá)呈陰性(圖5-圖6)。

2.4 Western blot檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 不同分組 Cyt C的表達(dá)特點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)組大鼠LEC 線粒體 Cyt C 含量為0.510 5±0.026 4，對(duì)照組為0.846 0±0.033 5，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組大鼠胞漿Cyt C含量為0.928 0±0.029 7，對(duì)照組為 0.525 0±0.025 8，2 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組胞漿內(nèi) Cyt C含量增多，線粒體內(nèi)Cyt C減少，說明在STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠LEC中Cyt C發(fā)生了位置轉(zhuǎn)移，由線粒體釋放到胞漿中。

Figure 1 Lens was trubid in experimental group 實(shí)驗(yàn)組大鼠晶狀體混濁

Figure 2 Lens was transparent in control group 對(duì)照組晶狀體透明

Figure 3 Expression of Cyt C in experimental group(×400) 實(shí)驗(yàn)組Cyt C表達(dá)情況(×400)

2.4.2 不同分組Caspase 3的表達(dá)特點(diǎn) 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠 LEC中 Caspase 3表達(dá)量為0.906 0±0.027 6，對(duì)照組表達(dá)量為0.430 5±0.025 2，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

Figure 4 Expression of Caspase 3 in experimental group(×400)實(shí)驗(yàn)組Caspase 3表達(dá)情況(×400)

Figure 5 Expression of Cyt C in control group(×400) 對(duì)照組Cyt C表達(dá)情況(×400)

Figure 6 Expression of Caspase 3 in control group(×400) 對(duì)照組Caspase 3表達(dá)情況(×400)

3 討論

糖尿病性白內(nèi)障是糖尿病的主要慢性并發(fā)癥之一［1］，其主要的臨床表現(xiàn)為晶狀體發(fā)生混濁導(dǎo)致視力下降甚至失明，主要病理學(xué)改變是LEC的異常增殖、遷移、分化引起前后囊下的纖維化、混濁［2］。

LEC的凋亡可能是各種非先天性白內(nèi)障的共同細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)［3］。大量研究表明，將人晶狀體上皮細(xì)胞(HLEC)培養(yǎng)于含高糖的培養(yǎng)基24 h后，細(xì)胞存活率顯著下降，并能檢測(cè)到細(xì)胞凋亡的發(fā)生［4-6］;Nambu等［7］在大鼠 LEC中也觀察到類似的結(jié)果。Takamura［8］在糖尿病動(dòng)物模型亦發(fā)現(xiàn)LEC出現(xiàn)明顯的凋亡特征。

由Fas/FasL介導(dǎo)的膜死亡受體通路和線粒體信號(hào)通路是細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。大量數(shù)據(jù)顯示，線粒體不僅是真核細(xì)胞內(nèi)主要的ATP生產(chǎn)中心，而且是調(diào)控細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)。在凋亡信號(hào)的作用下，Bcl-2促凋亡蛋白被激活，形成線粒體外膜通道，使線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)呈不可逆的高水平開放狀態(tài)，線粒體通透性發(fā)生改變，位于線粒體膜間隙的Cyt C等凋亡信號(hào)分子被釋放入胞漿，與Apaf-1和Caspase 9前體結(jié)合形成凋亡體，隨后激活Caspase 9，后者作為蛋白酶繼續(xù)活化下游的凋亡效應(yīng)分子 Caspase 3，激活 Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，發(fā)生DNA片段化、染色質(zhì)濃縮等特征性改變，最終導(dǎo)致不可逆的細(xì)胞死亡［9-10］。

Caspase是一類以無活性前體酶原(pro-caspase)的形式存在于細(xì)胞中的蛋白水解酶家族。細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，Caspase被激活并引發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［11］。Caspase 3是細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)因子，并與細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化緊密相關(guān)［10］。Cyt C是一種由核基因編碼的水溶性蛋白，位于線粒體內(nèi)膜外側(cè)呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ與Ⅳ之間，是電子傳遞鏈復(fù)合體中的一個(gè)組成部分，在呼吸鏈中起電子傳遞的作用。研究表明［12］，Cyt C不僅參與線粒體的能量代謝過程，而且是線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中不可或缺的重要因子，在凋亡過程中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，Cyt C mRNA表達(dá)上調(diào)，編碼合成Cyt C增多，同時(shí)在凋亡刺激因子作用下，合成的CytC從線粒體釋放入胞漿，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［13］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，STZ-糖尿病大鼠LEC中Cyt C由線粒體內(nèi)釋放到了胞漿中，通過激活Caspase 3從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生。

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