徐玲 周小煦 蘇暢 吳建國(guó)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最為常見(jiàn)并發(fā)癥，位居不可逆性致盲性眼底血管性疾病的首位，基于比較醫(yī)學(xué)的研究，采用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)大鼠是目前常用的DR動(dòng)物模型［1-3］。既然DR是以新生血管形成為主要標(biāo)志的糖尿病微血管并發(fā)癥，對(duì) DR的病因、病理、治療及預(yù)后等的研究必然涉及新生血管的形態(tài)學(xué)檢查。自40多年前，Difco實(shí)驗(yàn)室建立視網(wǎng)膜血管消化鋪片技術(shù)以來(lái)，其一直是研究DR的一種基本病理技術(shù)。但視網(wǎng)膜血管消化鋪片技術(shù)難度較大，國(guó)內(nèi)常用的胰蛋白酶消化技術(shù)常出現(xiàn)消化過(guò)度或消化不全、展片困難、鋪片不均一、視網(wǎng)膜損失較多，這些嚴(yán)重影響了對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析比較［4-7］。

近年研究發(fā)現(xiàn)，超聲波作用于含酶溶液(水相、有機(jī)相以及固定化酶)時(shí)，能產(chǎn)生空化、振蕩等作用，可使酶分子構(gòu)象及催化部位微環(huán)境發(fā)生變化，影響催化活性［8-10］。本研究嘗試將超聲波引入視網(wǎng)膜血管鋪片技術(shù)，觀察其用于DR大鼠模型中的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及糖尿病模型制作 健康雄性SD大鼠(體質(zhì)量200～250 g，天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)25只，制作1型糖尿病模型。按55 mg·kg－1劑量，尾靜脈注射 STZ(美國(guó) Sigma公司)，使用前以 0.1 mmol·L－1，pH 值 4.4 枸櫞酸緩沖液配成20 g·L－1的 STZ溶液。每周斷尾取血，血糖儀(JPS-6型，北京怡成生物電子技術(shù)有限公司)檢測(cè)大鼠血糖，以穩(wěn)定在 16.7 mmol·L－1以上為造模成功［3］，飼養(yǎng)8周。實(shí)驗(yàn)所有操作遵循天津醫(yī)科大學(xué)倫理學(xué)規(guī)定。

1.2 視網(wǎng)膜血管消化鋪片的制作 動(dòng)物以拋硬幣法隨機(jī)分成2組，第1組為胰蛋白酶機(jī)械振蕩消化組［3］，腹腔注射水合氯醛深度麻醉大鼠后，右心耳放血處死動(dòng)物，從主動(dòng)脈弓灌注生理鹽水30 mL，再灌注40 g·L－1多聚甲醛50 mL，取出眼球置于40 g·L－1多聚甲醛液中繼續(xù)固定，12 h后，取出眼球，在顯微鏡下操作，從赤道部剪開(kāi)眼球，去除眼前節(jié)和玻璃體，剩下的眼杯以視盤(pán)為中心切開(kāi)4瓣，然后以解剖針推下視網(wǎng)膜，室溫下 PBS浸泡24 h，期間換液4次。然后置于37℃ 30 g·L－1胰蛋白酶Tris緩沖液中消化，胰蛋白酶消化的同時(shí)每隔20 min，使用脫色搖床(TY80B，南京大學(xué)儀器廠)機(jī)械振蕩2 min;2 h后，將消化后已經(jīng)極薄的視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移入PBS，反復(fù)吹打，直至神經(jīng)成分完全去掉，僅剩下一層透明的視網(wǎng)膜血管網(wǎng)，水洗轉(zhuǎn)移至載玻片上鋪平，自然干燥后，常規(guī)行PAS和蘇木素染色。第2組為超聲波輔助胰蛋白酶振蕩消化組，視網(wǎng)膜前期處理和后期的PAS染色與第1組完全一致，只是在胰蛋白酶消化的同時(shí)，每隔20 min置于超聲波清洗機(jī)(H66025-P型，無(wú)錫市超聲電子設(shè)備)水槽中，處理參數(shù):16.5 kHz、50 W，作用2 min。

1.3 形態(tài)學(xué)觀察 顯微鏡下觀察，以視網(wǎng)膜四個(gè)象限完整，保留4根以上完整的視網(wǎng)膜主動(dòng)脈干及血管分支，無(wú)或極少神經(jīng)上皮殘余的結(jié)果為成功鋪片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，2組率的比較使用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 6周后，有20只動(dòng)物符合糖尿病大鼠模型的血糖標(biāo)準(zhǔn)。動(dòng)物造模后3 d即開(kāi)始出現(xiàn)明顯的“三多”癥狀，每日飲食、飲水和尿量明顯增加，而體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢甚至有所減輕，毛色干枯。

2.2 兩種鋪片成功率比較 超聲波輔助胰蛋白酶振蕩消化組獲得了17張(85%)理想的鋪片結(jié)果，胰蛋白酶機(jī)械振蕩組獲得11張(55%)，前者的鋪片成功率較高(P ＜0.05)。

2.3 形態(tài)學(xué)觀察 糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管鋪片上出現(xiàn)了不同程度的毛細(xì)血管形態(tài)改變，如毛細(xì)血管網(wǎng)排列紊亂，走向不規(guī)則，多根毛細(xì)血管扭曲成叢;毛細(xì)血管管腔粗細(xì)不等，或節(jié)段膨大，呈囊樣擴(kuò)張;周細(xì)胞核明顯固縮，數(shù)目顯著減少，內(nèi)皮細(xì)胞明顯增生(圖1)。

Figure 1 Retinal vessels digest preparation of diabetes rats.The black arrow in figure A was truncus aortae，the red arrow was the second order vessel branch;The black arrow in figure B was pyknosis of pericytes，the red arrow was capillary with no cell 糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管消化鋪片。A中黑箭頭為主動(dòng)脈干，紅箭頭為2級(jí)血管分支(×40);B中黑箭頭為周細(xì)胞核固縮，紅箭頭為無(wú)細(xì)胞毛細(xì)血管(×400)

3 討論

制作視網(wǎng)膜血管消化鋪片的關(guān)鍵在于徹底去掉神經(jīng)成分，即通過(guò)酶將神經(jīng)組織消化后再用機(jī)械力量去掉。為獲得理想的結(jié)果，多年來(lái)此技術(shù)改進(jìn)一直不曾停頓［4-7］。從最初單純的胰蛋白酶恒溫水浴消化2～3 h，優(yōu)化為搖床機(jī)械振蕩輔助消化［4-5］，從粗提純的胰蛋白酶優(yōu)化為精制提純的膠原酶或胃蛋白酶-胰蛋白酶復(fù)合物等［6-7］，從肉眼吹打發(fā)展到顯微鏡下定向吹打技巧，及自制玻璃器械移動(dòng)血管網(wǎng)轉(zhuǎn)移血管網(wǎng)到載玻片上［4-5］。實(shí)際上，幾乎所有的鋪片困難，都與酶的效率有關(guān)，如展片困難就是源于神經(jīng)細(xì)胞殘留過(guò)多，血管網(wǎng)被消化過(guò)度也是源于酶不能均勻一致消化視網(wǎng)膜組織。由此可見(jiàn)，解決問(wèn)題的核心還是在于如何提高酶均勻一致的消化能力。

近年來(lái)有研究者從酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、紫外吸收光譜、紫外差示光譜、熒光發(fā)射光譜等方面研究，發(fā)現(xiàn)超聲波作用于胰蛋白酶的反應(yīng)系統(tǒng)時(shí)，利用空化作用原理使胰蛋白酶分子構(gòu)象改變，使其活力中心更加能接觸底物，增強(qiáng)酶分子對(duì)底物的親和力，Km值降低，從而提高酶分子的催化活力［8-10］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲波輔助胰蛋白酶消化，較搖床機(jī)械振蕩方法，獲得的理想鋪片數(shù)量明顯提高。一方面，超聲波均勻提高了胰蛋白酶消化視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的能力，避免了消化不足和消化過(guò)度的情況;另一方面，超聲波又能形成機(jī)械振蕩將神經(jīng)細(xì)胞從血管網(wǎng)上分離出來(lái)，神經(jīng)組織越少，大鼠視網(wǎng)膜血管網(wǎng)的展片就越容易，損失的血管網(wǎng)也越少。

總之，本研究提示超聲波輔助胰蛋白酶的方法，可獲得高質(zhì)量的大鼠視網(wǎng)膜血管鋪片，為進(jìn)一步研究糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制提供了穩(wěn)定可靠的技術(shù)方法。

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