葉芬 吳艷 施宇華 黃振平

角膜的透明性是角膜發(fā)揮正常生理功能的基礎(chǔ)［1］。眼表化學(xué)傷，尤其眼表堿燒傷是一種常見的眼科急診疾病。在角膜堿燒傷的愈合過程中，由于角膜新生血管和角膜瘢痕的形成，嚴(yán)重破壞了角膜透明性，影響患者視力，甚至導(dǎo)致角膜盲［2］。因此在角膜傷口愈合過程中，不僅要修復(fù)其受傷部位，更重要的是盡量維持角膜透明性。目前臨床上的治療方法主要是角膜移植等手術(shù)治療。但是由于角膜移植供體匱乏，以及角膜植片的異體性，極易發(fā)生角膜排斥反應(yīng)，從而限制了角膜移植手術(shù)在臨床上的廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)的羊膜移植術(shù)，雖然可以抑制角膜新生血管，促進(jìn)角膜上皮愈合，但是手術(shù)操作復(fù)雜，羊膜保存困難［3-4］。本次我們通過使用羊膜勻漿提取液(extraction of amniotic membrane，EAM)，觀察在堿燒傷愈合中其對角膜瘢痕形成的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 大鼠角膜堿燒傷模型的制作 取SD大鼠40只(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供)，體質(zhì)量180～200 g，清潔級，雌雄不限。用 0.6 mol·L－1水合氯醛+安定腹腔注射(3 mL·kg－1)麻醉大鼠后，在裂隙燈顯微鏡下檢查見大鼠角膜透明。隨機(jī)分為EAM組和對照組各20只，表面麻醉2次后，將直徑為3 mm圓形濾紙片浸入1 mol·L－1NaOH溶液20 s，濾紙吸去過多堿液，將其貼敷于右眼角膜中央40 s。立即用生理鹽水沖洗燒傷區(qū)及結(jié)膜囊直至pH=7，涂紅霉素及硫酸阿托品眼膏預(yù)防感染并散瞳預(yù)防虹膜后粘連。損傷后EAM組行EAM滴眼，對照組行PBS滴眼，每天4次。

1.2 EAM的制備 新鮮人羊膜來源于我院產(chǎn)科健康剖宮產(chǎn)孕婦，排除艾滋病、乙肝、梅毒等傳染性疾病。用含 50 μg·mL－1青霉素、50 μg·mL－1慶大霉素和2.5 μg·mL－1兩性霉素 B的生理鹽水沖洗羊膜3遍，鈍性分離后剪成5 cm×5 cm大小，在PBS液中清洗3次，稱質(zhì)量后置于10 mL離心管中，按1∶1加入 PBS 液，放入勻漿機(jī)中(5000 r·min－1，30 s)，勻漿后按1∶5加入無菌PBS液，離心后取上清液(2 h內(nèi)使用)。EAM 蛋白含量為800 μg·mL－1。

1.3 裂隙燈顯微鏡觀察及眼前節(jié)照相 堿燒傷后每日行裂隙燈顯微鏡觀察大鼠角膜上皮的愈合情況，是否存在前房積血、角膜潰瘍、角膜穿孔等并發(fā)癥，并行眼前節(jié)照相，觀察并記錄角膜透明度及混濁情況。

角膜混濁評分標(biāo)準(zhǔn):分為0分:全角膜透明、眼內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰可見;1分:輕微角膜表層混濁;2分:角膜淺層基質(zhì)混濁，瞳孔緣和虹膜紋理可見;3分:中度角膜基質(zhì)混濁，只可見瞳孔緣;4分:重度角膜基質(zhì)混濁，前房可見;5分:角膜混濁嚴(yán)重，前房模糊［5］。

1.4 角膜共聚焦顯微鏡觀察 實驗大鼠麻醉后，右眼行開瞼器開瞼，滴用vidisic眼凝膠。調(diào)整操縱臺高度和CCD攝像頭位置，在物鏡頭表面滴1滴vidisic眼凝膠，蓋上一次性無菌角膜接觸帽。將鼠眼固定于物鏡上，觀察角膜基質(zhì)層肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)。觀察視野為400 μm×400 μm，分辨率為1 μm，放大倍數(shù)為800。通過Rostock操作軟件對同層圖像中的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)［6］。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裂隙燈顯微鏡觀察 角膜堿燒傷后，兩組均出現(xiàn)角膜變白，角膜上皮缺失。對照組堿燒傷后第1天角鞏膜緣血管網(wǎng)充盈，淺層基質(zhì)水腫;第3天角膜緣可見毛刷狀新生血管生長，并向透明角膜伸入，形成環(huán)狀和袢狀;第4天角膜上皮基本愈合;第11天可見大量密集粗亂的新生血管長入角膜，此時新生血管面積最大，隨后新生血管生長速度明顯減慢，角膜斑翳形成;第28天角膜新生血管逐漸減退，角膜透明性明顯下降。EAM組堿燒傷后第3天角膜上皮基本愈合;第8天新生血管面積最大，但比對照組分布局限且稀疏;第9天新生血管基本停止生長，角膜云翳形成，但透明性較對照組好。

2.2 堿燒傷后28 d兩組角膜透明性評分比較 堿燒傷后28 d，對照組角膜斑翳明顯，透明性下降，瞳孔緣模糊可見，角膜評分為(3.36±1.12)分，EAM組角膜白斑較薄，評分為(2.36±0.81)分，兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

2.3 角膜共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果 角膜共聚焦顯微鏡觀察角膜基質(zhì)層結(jié)構(gòu)的改變:堿燒傷后第3天，對照組淺層基質(zhì)細(xì)胞水腫，細(xì)胞體積變大，胞體變形，細(xì)胞邊界模糊，胞核反光減弱(圖1A)。EAM組的角膜上皮快速愈合，其缺損的角膜上皮細(xì)胞小于對照組(圖2A)。燒傷后第4天對照組在細(xì)胞形態(tài)模糊不清的基質(zhì)細(xì)胞背景中，出現(xiàn)數(shù)量不等、分布不均、胞體較小、胞核反光明亮的炎癥細(xì)胞?；|(zhì)內(nèi)神經(jīng)發(fā)生較多分叉，神經(jīng)分支走行不平行伴屈曲，粗細(xì)不均，并見異常交通支，這些炎癥細(xì)胞多分布于神經(jīng)周圍(圖1B)。此時 EAM組基質(zhì)細(xì)胞界限欠清，胞體呈多角形突起，排列紊亂，且密度低于正常，胞體反光較強(qiáng)，細(xì)胞核很難分辨，炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯小于對照組(圖2B)。堿燒傷后第9天，對照組基質(zhì)膠原纖維斷裂溶解，膠原纖維排列紊亂，板層纖維結(jié)構(gòu)疏松?；|(zhì)層可見大量肌成纖維細(xì)胞，胞質(zhì)豐富，胞體呈多角形突起，伴有炎癥細(xì)胞浸潤，多個成纖維細(xì)胞相互連接成蜂窩狀，逐漸形成纖維化(圖1C)。EAM組基質(zhì)層細(xì)胞間隙暗區(qū)擴(kuò)大，可見細(xì)小炎性細(xì)胞呈點(diǎn)狀浸潤，肌成纖維細(xì)胞胞質(zhì)豐富，細(xì)胞邊界尚清晰，排列較為規(guī)則(圖2C)。堿燒傷后第11天，對照組整個角膜區(qū)域幾乎均有角膜新生血管形成，角膜下方最為明顯，管腔粗大并相互交織成網(wǎng)狀，管壁界限清晰，動態(tài)連續(xù)掃描模式可見血管內(nèi)血細(xì)胞流動(圖1D)。EAM組新生血管稀疏，分支以及迂曲程度較少(圖2D)。堿燒傷后第28天，對照組基質(zhì)內(nèi)神經(jīng)纖維走行方向呈放射狀，基質(zhì)細(xì)胞胞核拉長，細(xì)胞間隙加寬，基質(zhì)內(nèi)大量無細(xì)胞結(jié)構(gòu)的高反光區(qū)域，瘢痕形成范圍較大(圖1E)。EAM組基質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞幾乎不可見，角膜新生血管消退明顯，高反光的無結(jié)構(gòu)區(qū)域較對照組明顯較少(圖2E)。

2.4 兩組基質(zhì)層肌成纖維細(xì)胞計數(shù)比較 堿燒傷后第9天，對照組基質(zhì)層肌成纖維細(xì)胞密度為(291±48)個·mm－2，EAM 組為(201±39)個·mm－2，兩者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.45，P ＜0.01);堿燒傷后第11天，對照組肌成纖維細(xì)胞密度達(dá)到最大值，為(349±105)個·mm－2，此時 EAM 組為(248±84)個·mm－2，兩者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.81，P ＜0.01);堿燒傷后第14天，兩組角膜基質(zhì)層肌成纖維細(xì)胞密度均減少，但是對照組的細(xì)胞密度仍然大于EAM組，兩組分別為(175±62)個·mm－2、(108±57)個·mm－2(t=2.98，P ＜0.01)。

Figure 1 Control groups.A:Three days after corneal alkali burns，corneal epithelial cells were defected in some aera;B:Four days after corneal alkali burns，more inflammatory cells with high-reflective nuclei appeared;C:Seven days after corneal alkali burns，the corneal stroma was arranged irregularly with proliferation and activation of myofibroblasts;D:Eleven days after corneal alkali burns，the area of neovascularization in stroma layer was maximum;E:At 28 day after corneal alkali burns，corneal scar formed in the stroma layer.圖1 對照組角膜激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。A:堿燒傷后第3天，部分區(qū)域角膜上皮細(xì)胞缺損;B:堿燒傷后第4天，大量炎癥細(xì)胞出現(xiàn);C:堿燒傷后第7天，基質(zhì)層纖維排列紊亂，肌成纖維細(xì)胞激活并增殖;D:堿燒傷后第11天，基質(zhì)層新生血管面積達(dá)到最大;E:堿燒傷后第28天，基質(zhì)層角膜瘢痕形成。

Figure 2 EAM groups.A:Three days after corneal alkali burn，the corneal epithelial defected area in experiment groups was less than control group;B:Four days after corneal alkali burn，less inflammatory cells appeared;C:Seven days after corneal alkali burn，the corneal stroma was arranged regularly with no proliferative myofibroblasts;D:Eleven days after corneal alkali burn，the area of neovascularization in stroma layer was less than control group，and the density was lower;E:At 28 day after corneal alkali burn，less corneal scar existed in the stroma layer圖2 EAM組角膜激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。A:堿燒傷后第3天，角膜上皮細(xì)胞缺損區(qū)域小于對照組;B:堿燒傷后第4天，可見少量炎癥細(xì)胞出現(xiàn);C:堿燒傷后第7天，基質(zhì)層肌成纖維細(xì)胞呈靜止?fàn)顟B(tài);D:堿燒傷后第11天，基質(zhì)層可見新生血管，面積和密度較對照組小;E:堿燒傷后第28天，基質(zhì)層可見少量角膜瘢痕形成

3 討論

角膜堿燒傷是眼科常見急癥之一。主要通過以下途徑對眼表造成病理損害，引起角膜血管化、角膜瘢痕化以及對眼表組織結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重的破壞。首先堿性離子具有強(qiáng)滲透性以及強(qiáng)腐蝕性，可以迅速擴(kuò)散到眼部深層組織，引起廣泛的組織壞死，破壞角膜透明性;其次堿性物質(zhì)具有角膜酶作用，可以溶解角膜細(xì)胞內(nèi)外的酶蛋白，阻礙膠原形成，導(dǎo)致角膜基質(zhì)愈合延遲;而且堿性離子可以破壞角鞏膜緣血液循環(huán)，影響角膜上皮的血液供應(yīng)，導(dǎo)致持續(xù)性角膜上皮缺損;最后堿性物質(zhì)可引起白細(xì)胞大量浸潤，釋放多種蛋白酶，引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，破壞穩(wěn)定的角膜微循環(huán)［7-8］。

角膜基質(zhì)中膠原纖維板的有序排列是維持角膜透明的基礎(chǔ)，損傷后不能再生，由瘢痕代替;角膜基質(zhì)創(chuàng)傷后，角膜細(xì)胞被激活、增殖、分化［9］。而角膜細(xì)胞是一種纖維細(xì)胞，可分泌角膜纖維并激活成纖維細(xì)胞，這些成纖維細(xì)胞具有肌成纖維細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征，是瘢痕形成中起重要作用的細(xì)胞，其激活、增殖、分化是瘢痕形成中的重要因素［10］。堿燒傷后成纖維細(xì)胞大量增殖且凋亡受抑制，角膜的合成與降解失衡，大量細(xì)胞因子的產(chǎn)生。原來相對惰性的角膜實質(zhì)細(xì)胞變的細(xì)長，呈紡錘形，于是靜止的成纖維細(xì)胞被激活，分泌大量不規(guī)則的前膠原和膠原纖維以促進(jìn)角膜基質(zhì)層傷口的愈合［11］。纖維組織雖然填滿角膜缺損，但是新的膠原纖維排列不規(guī)則，其直徑和纖維之間間隙改變，失去原先的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，引起角膜透明度下降，形成角膜瘢痕。同時如果角膜中央神經(jīng)走行不規(guī)則，也可以影響中央角膜的透光性。本研究中EAM組角膜透明性明顯好于對照組。使用激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)，堿燒傷后第7天，對照組可見大量成纖維細(xì)胞增殖，堿燒傷后第11天，可見纖維排列紊亂，堿燒傷后第28天，對照組基質(zhì)層和內(nèi)皮細(xì)胞層可見大量無細(xì)胞結(jié)構(gòu)的瘢痕組織。而EAM組成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯少于對照組，角膜基質(zhì)層纖維排列較規(guī)則，瘢痕組織較少。說明羊膜勻漿提取液可以抑制成纖維細(xì)胞的增殖和激活，促進(jìn)膠原纖維的有序排列，減少角膜瘢痕的形成。EAM抑制角膜瘢痕形成的機(jī)制尚不明確，可能與其在角膜創(chuàng)傷愈合過程中，抑制角膜成纖維細(xì)胞的增殖和生長有關(guān)。已有研究證實，人EAM可以通過抑制兔角膜成纖維細(xì)胞中TGFβ1 mRNA表達(dá)，從而抑制角膜成纖維細(xì)胞增殖，并且其抑制作用隨EAM所含蛋白濃度的增加而增強(qiáng)［12-13］。因此推測 EAM中所含的肝細(xì)胞生長因子及受體等細(xì)胞因子具有抑制TGFβl mRNA表達(dá)，減少結(jié)締組織生長因子表達(dá)的作用［14-15］。也有學(xué)者認(rèn)為EAM中的生物活性因子通過單一或網(wǎng)絡(luò)的作用促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶的合成和分泌，從而使MMP降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用增強(qiáng)，起到抑制術(shù)后纖維化、瘢痕形成的作用。于是猜測，EAM可能通過其中的活性成分對影響成纖維細(xì)胞表達(dá)的各種細(xì)胞因子發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，同時通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子的活性，調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的分化和表達(dá)。

綜上所述，EAM可以通過抑制大鼠堿燒傷后角膜炎癥細(xì)胞浸潤，抑制成纖維細(xì)胞增殖，抑制大鼠堿燒傷后角膜瘢痕形成以及新生血管形成。EAM有可能應(yīng)用于臨床角膜化學(xué)燒傷患者，但是其作用機(jī)理以及臨床應(yīng)用的最佳濃度和作用時間有待進(jìn)一步開展基礎(chǔ)研究和臨床試驗研究。

1 Wagoner MD.Chemical injuries of the eye:current concepts in pathophysiology and therapy［J］.Surv Ophthalmol，1997，41(4):275-313.

2 Choi JA，Jin HJ，Jung S，Yang E，Choi JS，Chung SH，et al.Effects of amniotic membrane suspension in human corneal wound healing in vitro［J］.Mol Vis，2009，15(5):2230-2238.

3 曾波，周雄，周和政.角膜潰瘍多層羊膜移植術(shù)后早期組織病理學(xué)與臨床分析［J］.眼科新進(jìn)展，2012，32(8):750-752.

4 Baradaran-Rafii A，Aghayan HR，Arjmand B，Javadi MA.Amniotic membrane transplantation［J］.J Ophthalmic Vis Res，2008，2(1):58-75.

5 Tseng SC，Prabhasawat P，Lee SH.Amniotic membrane transplantation for conjunctival surface reconstruction［J］.Am J Ophthalmol，1997，124(6):765-774.

6 吳艷，楊麗萍，薛春燕，黃振平，石堯.激光共焦顯微鏡對近視激光術(shù)后 haze結(jié)構(gòu)的研究［J］.眼科新進(jìn)展，2013，33(3):240-242.

7 Wagoner MD.Chemical injuries of the eye:current concepts in pathophysiology and therapy［J］.Surv Ophthalmol，1997，41(4):275-313.

8 陳酉，晏曉明，吳海榮，榮蓓.羊膜移植治療大鼠角膜堿燒傷后羊膜轉(zhuǎn)歸的研究［J］.中華眼科雜志，2012，48(1):27-32.

9 Rauz S，Saw VP.Serum eye drops，amniotic membrane and limbal epithelial stem cells-tools in the treatment of ocular surface disease［J］.Cell Tissue Bank，2010，11(1):13-27.

10 Zhang S，He H，Day AJ，Tseng SC.Constitutive expression of inter-αinhibitor(IαI)family proteins and tumor necrosis factor-stimulated gene-6(TSG-6)by human amniotic membrane epithelial and stromal cells supporting formation of the heavy chain-hyaluronan(HC-HA)complex［J］.J Biol Chem，2012，287(15):12433-12444.

11 Kim TH，Lee DY，Rho JH，Rho SH，Yoo KW，Ahn HB，et al.Application of newly developed amniotic membrane ointment for photorefractive keratectomy in rabbits［J］.Ophthalmic Res，2006，38(2):58-61.

12 Koizumi NJ，Inatomi TJ，Sotozono CJ.Growth factor mRNA and protein in preserved human amniotic membrane［J］.Curr Eye Res，2000，20(3):173-177.

13 Schulze U，Hampel U，Sel S，Goecke TW，Th?le V，Garreis F，et al.Fresh and cryopreserved amniotic membrane secrete the trefoil factor family peptide 3 that is well known to promote wound healing［J］.Histochem Cell Biol，2012，138(2):243-250.

14 Tseng SCG，Espana EM，Kawakita T，Di Pascuale MA，Li W，He H，et al.How does amniotic membrane work［J］?Ocul Surf，2004，2(3):177-187.

15 Tall EG，Bernstein AM，Oliver N，Gray JL，Masur SKl.TGF-β-stimulated CTGF production enhanced by collagen and associated with biogenesis of a novel 31-kDa CTGF form in human corneal fibroblasts［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2010，51(10):5002-5011.