賀司宇 劉素素 張紅敏 王麗婭

糖尿病能引起全身多器官并發(fā)癥，其在眼部主要表現(xiàn)為糖尿病視網(wǎng)膜病變。近年來(lái)，隨著糖尿病發(fā)病率的不斷增加，對(duì)于糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的認(rèn)識(shí)也不斷深入，糖尿病引起的角膜改變正在逐漸引起人們的重視［1］。糖尿病能導(dǎo)致角膜上皮損傷后修復(fù)延遲［2］，而角膜上皮缺損已經(jīng)被證明可能誘發(fā)角膜基質(zhì)混濁、結(jié)構(gòu)紊亂以及感染性角膜炎，最終甚至危及視力［3］。目前，對(duì)糖尿病引起的角膜改變?nèi)狈ι钊肓私狻Ｐ∈笈c人類基因的同源性最高，糖尿病并發(fā)角膜改變的研究以兔、大鼠為主，對(duì)于糖尿病所引起小鼠角膜改變卻知之甚少。因此，本研究對(duì)糖尿病小鼠角膜的創(chuàng)傷修復(fù)以及角膜神經(jīng)是否發(fā)生改變進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 8周齡雄性昆明白小鼠購(gòu)自南京大學(xué)模型動(dòng)物研究所。小鼠購(gòu)回后，于18～20℃、明暗交替環(huán)境飼養(yǎng);建模前將小鼠禁食(不禁水)12 h，稱量空腹體質(zhì)量，尾端取血測(cè)定血糖濃度。血糖濃度 ≤7.4 mmol·L-1的小鼠80只納入實(shí)驗(yàn)。按照建模條件的不同，隨機(jī)分為對(duì)照組和糖尿病模型組(模型組)，每組各40只。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、檸檬酸鈉均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，DAPI購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，F(xiàn)ITC-Gr-1大鼠抗小鼠抗體、PE-CD31大鼠抗小鼠抗體均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司，Tubulin β-Ⅲ兔抗小鼠神經(jīng)抗體購(gòu)自美國(guó) R＆D公司，熒光顯微鏡及配套AR 3.2圖像分析軟件購(gòu)自日本尼康公司。

1.2 方法

1.2.1 STZ 注射液配制 120 mg STZ 溶于0.1 mol·L-1pH 4.5檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，定容至6 mL，在冰浴條件下充分溶解，過濾消毒?，F(xiàn)用現(xiàn)配，每次配制后15～20 min內(nèi)用完。

1.2.2 動(dòng)物模型建立 對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)，注射無(wú)菌檸檬酸緩沖液。模型組空腹后12 h進(jìn)行STZ腹腔注射，給藥量為200 mg·kg-1，注射后第1天晚上給予100 g·L-1蔗糖水以避免低血糖，24 h后測(cè)定血糖。給予高糖高脂飲食，非禁食狀態(tài)血糖≥11.1 mmol·L-1者為造模成功，并連續(xù)監(jiān)測(cè) 0 h、24 h、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d 血糖濃度、體質(zhì)量。

1.2.3 角膜上皮創(chuàng)傷模型制作與愈合速率測(cè)定使用無(wú)菌手術(shù)刀片，只刮除上皮層，前彈力層盡量完整保留，在不同時(shí)間點(diǎn)，將小鼠放在體視顯微鏡下，用20 g·L-1熒光素鈉滴眼，PBS沖洗染料，1 min內(nèi)用相同的參數(shù)拍攝圖像，用AR圖像分析軟件計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)(同1.2.2中時(shí)間點(diǎn))的創(chuàng)傷面積。

1.2.4 中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況觀察與計(jì)數(shù) 創(chuàng)傷后48 h，分別采用PE-CD31和FITC-Gr-1抗體對(duì)血管和中性粒細(xì)胞染色。摘取完整小鼠角膜;20 g·L-1多聚甲醛固定45 min，PBS沖洗3次 ×5 min;1 g·L-1Triton 100-BSA破膜20 min;20 g·L-1BSA封閉20 min;加入 FITC-Gr-1(1 g·L-1Triton 100-BSA 300 μL+1.3 μL 抗體)、PE-CD31(1 g·L-1Triton 100-BSA 300 μL+1.5 μL 抗體)孵育4 ℃過夜，PBS避光沖洗3次 ×5 min;0.2 mg·L-1DAPI復(fù)染30 min;PBS避光沖洗3次×5 min;將角膜平鋪于載玻片上，用鑷子展開角膜片，吸水紙吸去多余PBS，采用熒光封片膠封片。熒光顯微鏡下觀察，在整個(gè)角膜不同區(qū)域均勻隨機(jī)選擇16個(gè)視野拍照，進(jìn)行中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.5 神經(jīng)纖維染色與定量 于造模成功后9周分別取各組小鼠5只，取完整小鼠角膜，20 g·L-1多聚甲醛固定45 min，PBS沖洗3次×5 min;1 g·L-1Triton 100-BSA破膜20 min;20 g·L-1BSA封閉20 min;加入含4 μL Tubulin β-Ⅲ抗體的1 g·L-1Triton 100-BSA 1 mL，4℃孵育過夜，PBS避光沖洗3次 ×5 min;0.2 mg·L-1DAPI復(fù)染30 min，PBS避光沖洗3次×5 min;將角膜平鋪于載玻片上，用鑷子展開角膜片，吸水紙吸去多余PBS，采用熒光封片膠封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。在所得的角膜片共聚焦圖片上隨機(jī)疊加等距測(cè)點(diǎn)框，分別計(jì)數(shù)落在整個(gè)圖片內(nèi)及圖片神經(jīng)纖維上的測(cè)點(diǎn)數(shù)。根據(jù)以下公式計(jì)算［4］:Vfn= ∑Pfn/∑P;Vfn:神經(jīng)纖維密度;∑Pfn:落在圖片神經(jīng)纖維上的測(cè)點(diǎn)數(shù)之和;∑P:落在整個(gè)圖片內(nèi)的測(cè)點(diǎn)數(shù)之和。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間顯著性差異分析使用One-way ANOVA。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠血糖升高與體質(zhì)量下降 在進(jìn)行腹腔STZ注射之前，兩組小鼠的血糖濃度均處于5.9～7.4 mmol·L-1的正常范圍內(nèi)，且組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.858，見表1)。對(duì)照組小鼠注射無(wú)菌檸檬酸緩沖液后24 h血糖濃度為(6.7±0.2)mmol·L-1，模型組升高至(17.1±0.5)mmol·L-1，2 d后模型組血糖濃度升高并維持在25～30 mmol·L-1范圍內(nèi)(表1)，兩組間造模后 24 h、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d 血糖值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)。在體質(zhì)量方面對(duì)照組小鼠維持了正常的體質(zhì)量增長(zhǎng)，在注射無(wú)菌檸檬酸緩沖液后6 d體質(zhì)量為(38.4±0.4)g，增長(zhǎng)了8.1%，模型組小鼠的體質(zhì)量為(28.2±0.9)g，減輕了14.1%，僅為對(duì)照組小鼠的81.7%(表2)。除造模后0 h、24 h外，其余時(shí)間點(diǎn)兩組間體質(zhì)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)。

2.2 角膜上皮創(chuàng)傷修復(fù)延遲 對(duì)照組小鼠角膜初始創(chuàng)傷面積為(264 277±940)μm2，模型組初始創(chuàng)傷面積為(282 140±506)μm2，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.376)。造模后24 h后對(duì)照組創(chuàng)傷面積為(185 550±792)μm2，模型組為(225 454±826)μm2，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026)。創(chuàng)傷后4 d時(shí)對(duì)照組完全愈合(385±44)μm2(圖1)，而模型組創(chuàng)傷面積為(119 877±529)μm2，和對(duì)照組間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，至9 d后才可見創(chuàng)傷基本愈合(476±42)μm2，比對(duì)照組愈合延遲了5 d。2.3 角膜上皮創(chuàng)傷后中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況 對(duì)照組小鼠角膜緣血管廣泛分布，且中性粒細(xì)胞和血管伴行;而模型組小鼠角膜中血管分布稀少，中性粒細(xì)胞雖然仍與血管伴行，但是數(shù)量較少(圖2)。對(duì)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，創(chuàng)傷后2 d對(duì)照組為(212.3±6.3)個(gè)/視野，而模型組為(184.7±3.2)個(gè)/視野，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組小鼠的血糖Table 1 Blood glucose of each group(ˉx±s，n=5，c/mmol·L-1)

表2 各組小鼠的體質(zhì)量Table 2 Body weight of each group(xˉ±s，n=5，m/g)

Figure 1 Cornea wound healing at different time points of two groups 兩組創(chuàng)傷后不同時(shí)間角膜愈合情況

Figure 2 Distribution of blood vascular and neutrophils.A-D:Control group;E-H:Diabetes group 創(chuàng)傷后血管和中性粒細(xì)胞分布。A-D為對(duì)照組;E-H為模型組

2.4 糖尿病小鼠角膜神經(jīng)分布 兩組小鼠角膜Tubulin β-Ⅲ神經(jīng)抗體染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠中央、旁中央、周邊角膜都有神經(jīng)纖維卷曲、水腫、變性甚至壞死，并且神經(jīng)纖維減少(圖3)。對(duì)神經(jīng)纖維密度定量分析顯示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠角膜的各個(gè)區(qū)域均顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05，見表3)。

表3 各組小鼠神經(jīng)纖維密度Table 3 Nerve fiber density of each group(n=5，Nerve fiber density/μm3·mm-3)

Figure 3 Distribution of nerve fiber of two groups 小鼠角膜神經(jīng)纖維分布

3 討論

3.1 STZ誘導(dǎo)形成糖尿病小鼠并影響小鼠生長(zhǎng)STZ對(duì)一定種屬動(dòng)物的胰島β細(xì)胞有選擇性破壞作用，能誘發(fā)特定動(dòng)物發(fā)生糖尿病。一般用于大鼠和小鼠糖尿病動(dòng)物模型的制備［5］。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射STZ誘導(dǎo)小鼠發(fā)生糖尿病，腹腔注射STZ后24 h，我們開始對(duì)小鼠血糖水平進(jìn)行監(jiān)控，可見小鼠血糖迅速升高并在2 d后穩(wěn)定在較高水平，其中造模后2 d、3 d、4 d、5 d、6 d，血糖值分別為(26.3±0.9)mmol·L-1、(27.6±1.9)mmol·L-1、(28.4±1.6)mmol·L-1、(28.7±1.2)mmol·L-1、(28.5±1.1)mmol·L-1，和對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)。隨著糖尿病小鼠血糖維持在較高水平，其生長(zhǎng)受到抑制，糖尿病小鼠的體質(zhì)量從2 d開始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并且和對(duì)照組小鼠相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。這和Daneshgari等［6］的報(bào)道結(jié)果一致，表明本研究糖尿病模型制作成功。

3.2 糖尿病小鼠角膜創(chuàng)傷愈合時(shí)間延遲分析 對(duì)照組小鼠角膜上皮可于創(chuàng)傷后4 d完全愈合。但是糖尿病小鼠創(chuàng)傷愈合時(shí)間顯著延后，通過持續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠角膜上皮創(chuàng)傷愈合時(shí)間延遲5 d，5只糖尿病模型小鼠的創(chuàng)傷徹底愈合時(shí)間在9 d(圖2)。從創(chuàng)傷后24 h開始糖尿病小鼠創(chuàng)傷愈合情況和對(duì)照組小鼠就存在明顯差異(均為P＜0.05)。本實(shí)驗(yàn)排除周齡、性別構(gòu)成比等可能影響小鼠角膜上皮創(chuàng)傷愈合的因素，其主要原因就是觀察糖尿病對(duì)組織創(chuàng)傷愈合的干擾。此結(jié)果不僅和糖尿病對(duì)全身創(chuàng)傷的表現(xiàn)一致，也和其他動(dòng)物糖尿病模型角膜中所觀察到的結(jié)果一致［7］。

基于上述結(jié)果，我們對(duì)可能引起角膜上皮創(chuàng)傷愈合延遲的因素進(jìn)行了分析。分別采用PE-CD31、FITC-Gr-1抗體和DAPI對(duì)血管、中性粒細(xì)胞染色，在熒光顯微鏡下觀察角膜創(chuàng)傷后血管、中性粒細(xì)胞的分布情況。對(duì)照組角膜緣血管分布均勻，可見中性粒細(xì)胞位于血管內(nèi)或者與血管伴行，模型組小鼠角膜緣血管比對(duì)照組纖細(xì)、稀疏(圖3)。中性粒細(xì)胞雖然仍分布于血管內(nèi)或者與血管伴行，但是數(shù)量少于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。關(guān)于中性粒細(xì)胞在角膜上皮細(xì)胞創(chuàng)傷愈合中所起的作用已有報(bào)道［8］，Marrazzo 等［9］認(rèn)為中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)對(duì)角膜上皮創(chuàng)傷后的修復(fù)有積極意義。本研究結(jié)果和上述報(bào)道一致，據(jù)此推斷糖尿病引起的血管數(shù)量的變化以及對(duì)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的影響，有可能是糖尿病引起角膜創(chuàng)傷愈合延遲的原因之一。

3.3 糖尿病小鼠角膜神經(jīng)分布改變 除與角膜創(chuàng)傷修復(fù)密不可分的中性粒細(xì)胞分布改變外，我們也觀察到模型組小鼠維持高血糖9周之后角膜神經(jīng)纖維分布發(fā)生了明顯變化，出現(xiàn)形態(tài)異常的神經(jīng)纖維(圖4)，這可能是神經(jīng)退行性變化的表現(xiàn)。對(duì)神經(jīng)纖維密度定量分析顯示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠角膜的各個(gè)區(qū)域均顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)。國(guó)內(nèi)外在其他糖尿病動(dòng)物模型中也有類似報(bào)道［10-11］，Wang 等［12］研究認(rèn)為糖尿病引起神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)cAMP和cGMP下調(diào)，從而改變角膜組織中神經(jīng)纖維分布的規(guī)則性，這和本研究觀察到的神經(jīng)纖維分布一致。此外有報(bào)道認(rèn)為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性減退會(huì)導(dǎo)致角膜潰瘍的反復(fù)發(fā)生［13］，也提示了本實(shí)驗(yàn)中所觀察到的創(chuàng)傷愈合延遲和神經(jīng)改變有某種內(nèi)在關(guān)聯(lián)。然而，糖尿病性神經(jīng)病變的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明［14］，這種改變對(duì)于角膜的影響還有待進(jìn)一步研究。

此外，由于受實(shí)驗(yàn)條件、技術(shù)手段限制，未能對(duì)糖尿病小鼠角膜可能發(fā)生的諸如角膜面積、厚度、質(zhì)地、角膜緣上皮細(xì)胞增殖與凋亡等進(jìn)行分析。除了中性粒細(xì)胞之外，還有哪些局部因素也發(fā)生了變化還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，作為一種全身性疾病，糖尿病有可能導(dǎo)致多系統(tǒng)、多臟器的并發(fā)癥發(fā)生，在角膜組織有可能導(dǎo)致角膜上皮的創(chuàng)傷愈合延遲，并且有可能損害患者視力。因此，糖尿病患者應(yīng)該特別注意避免角膜創(chuàng)傷，尤其是接受DR手術(shù)治療的患者應(yīng)避免角膜并發(fā)癥的發(fā)生。

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