韓延燕 曹永亮 梁冰 曲群 李娜娜

視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷(retinal ischemia-reperfusion injury，RIRI)即缺血性視網(wǎng)膜在恢復供血后發(fā)生不可逆性損傷而出現(xiàn)明顯的視功能障礙，RIRI是導致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層及內核層細胞凋亡的常見病理過程［1］，即刻早期應答基因 c-fos/c-jun是在缺血性損傷中能夠表達的重要凋亡基因。本實驗通過前房加壓建立RIRI模型，骨髓間充質干細胞(bone marrow-mesenchymal stem cells，BMSC)細胞懸液玻璃體腔注射，探討B(tài)MSC對RIRI保護作用及對凋亡基因c-fos/c-jun表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 成年健康無眼疾SD大鼠52只，雌雄不限，體質量250～300 g，室溫飼養(yǎng)，大鼠隨機抽簽分為正常組(4只)、模型組(24只)、BMSC組(24只)，模型組在缺血再灌注1 h后玻璃體腔注入PBS緩沖液，BMSC組在缺血再灌注1 h后玻璃體腔注入等量BMSC細胞懸液。

1.2 細胞培養(yǎng) 全骨髓法即干細胞貼壁法［2］，取3～4周齡SD大鼠，過度麻醉處死后放至體積分數(shù)75%酒精浸泡10 min，無菌條件下取兩側脛骨及股骨，將其兩端剪開，PBS緩沖液反復沖洗骨髓腔，將沖洗液離心，去除上清液，加入培養(yǎng)基反復吹打，移入培養(yǎng)瓶加入適量培養(yǎng)基，置于37℃、含體積分數(shù)5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5 d后首次換液，去除雜質及未貼壁的細胞，此后隔天換液，10 d后細胞融合80%～90%進行傳代培養(yǎng)。

1.3 動物模型制備及玻璃體腔注射

1.3.1 動物模型制備 前房加壓法制備 RIRI模型［3］:SD大鼠右眼常規(guī)氯霉素眼液滴眼3 d，10 g·L－1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉固定，復方托吡卡胺眼液滴眼散瞳，鹽酸奧布卡因眼液滴眼局部麻醉，將連有注射器的生理鹽水放于距大鼠右眼垂直距離150 cm處，針頭自角膜緣刺入前房，可見球結膜蒼白，角膜逐漸霧濁水腫，間接眼底鏡可見視網(wǎng)膜蒼白，血管灌注中斷，加壓約90 min逐漸降低瓶高，降至大鼠右眼平行，拔掉穿刺針頭，可見球結膜充血，角膜霧濁減輕，視網(wǎng)膜血供恢復，RIRI模型制備成功。送至動物房常溫飼養(yǎng)，術眼氯霉素眼液滴眼，每天3次。

1.3.2 玻璃體腔注射 RIRI模型制備成功1 h后10 g·L－1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，鹽酸奧布卡因眼液滴眼局部麻醉，BMSC組自角膜緣注入玻璃體腔BMSC細胞懸液5 μL(約含50×103個活細胞)，模型組注入等量PBS緩沖液，術眼氯霉素眼液滴眼，每天3次。

1.4 標本采集及處理 按再灌注后1 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 6個時間點過度麻醉處死大鼠，立即摘取術眼眼球，放入體積分數(shù)4%甲醛固定液固定，1 h后自角膜緣剪開角膜，去除角膜及晶狀體，放入體積分數(shù)4%甲醛固定液固定，24 h后流水沖洗及酒精梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟、包埋，以矢狀軸為平面且經(jīng)視神經(jīng)做連續(xù)切片，厚度5 μm。

1.5 c-fos/c-jun免疫組織化學染色 石蠟切片脫水，水浴箱抗原修復，體積分數(shù) 3%H2O2孵育10 min，PBS洗滌，滴加山羊血清封閉液孵育30 min，依次加入一抗(免抗大鼠c-fos多克隆抗體、免抗大鼠c-jun多克隆抗體)、生物素化二抗(山羊抗兔IgG)，SABC染色，DAB顯色，蘇木素復染，酒精梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

1.6 計算機圖像分析及統(tǒng)計學分析 c-fos、c-jun陽性染色呈棕黃色，應用IPP圖像分析系統(tǒng)進行分析，每只大鼠切片取2張(非連續(xù))，每張切片隨機取4個視野(視野面積 0.2 mm ×0.2 mm)計算 c-fos、cjun陽性細胞數(shù)，計算平均數(shù)。應用SPSS 17.0系統(tǒng)軟件包進行統(tǒng)計學分析，計量資料用表示，各組同一時間點比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 c-fos免疫組織化學染色 正常組各時間點均未見c-fos陽性表達;再灌注后1 h，模型組可見少量c-fos陽性表達，主要分布于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層細胞核內，內核層也可見散在分布，12 h陽性表達逐漸增加，24 h表達達高峰(圖1)，48 h陽性表達逐漸減弱，72 h表達明顯下降。BMSC組再灌注后各時間點c-fos的陽性表達趨勢同模型組，24 h陽性表達達高峰(圖2)，但BMSC組各時間點 c-fos陽性表達均低于模型組，其中再灌注后 1 h、6 h、12 h、24 h、48 h 兩組c-fos陽性表達細胞數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義(均為P ＜0.05，見表1)。

2.2 c-jun免疫組織化學染色 正常組各時間點均未見c-jun陽性表達;模型組可見c-jun在再灌注后1 h開始少量表達，12 h c-jun陽性表達逐漸增加，24 h陽性表達達高峰(圖3)，48 h表達逐漸減弱，72 h表達明顯下降。BMSC組再灌注后各時間點c-jun的陽性表達趨勢同模型組，再灌注后1 h可見少量表達，12 h陽性表達逐漸增加，24 h陽性表達達高峰(圖4)，48 h、72 h陽性表達逐漸下降，但 BMSC組各時間點c-jun陽性表達均低于模型組，其中再灌注后1 h、6 h、12 h、24 h、48 h 兩組 c-jun 陽性表達細胞數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義(均為P＜0.05，見表2)。

表1 模型組與BMSC組再灌注后不同時間c-fos的陽性細胞數(shù)Table 1 Number of c-fos positive cells at different time points in model group and BMSC group(ˉx±s，cell·mm －2)

Figure 1 Expression of c-fos in retinal ganglion cells of model group at 24 hours after RIRI(×400) 模型組RIRI后24 h視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞c-fos表達情況(×400)Figure 3 Expression of c-jun in retinal ganglion cells of model group at 24 hours after RIRI(×400) 模型組RIRI后24 h視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞c-jun表達情況(×400)

Figure 2 Expression of c-fos in retinal ganglion cells of BMSC group at 24 hours after RIRI(×400)BMSC組RIRI后24 h視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞c-fos表達情況(×400)Figure 4 Expression of c-fos in retinal ganglion cells of BMSC group at 24 hours after RIRI(×400)BMSC組RIRI后24 h視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞c-jun表達情況(×400)

表2 模型組與BMSC組再灌注后不同時間點c-jun的陽性細胞數(shù)Table 2 Number of c-jun positive cells at different time points in model group and BMSC group(xˉ±s，cell·mm －2)

3 討論

缺血性眼病恢復再灌注時并不能緩解細胞損傷，反而加劇了細胞代謝障礙及結構的破壞［4］。研究發(fā)現(xiàn)RIRI是通過誘導視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)生凋亡，從而導致不可逆性損傷［5］，在視網(wǎng)膜缺血性疾病的防治中，如何做到既能保證盡早恢復視網(wǎng)膜組織的血供、又能減輕或防止缺血-再灌注性損傷的發(fā)生是非常重要的。

Otori等［6］報道缺血再灌注的視網(wǎng)膜組織 c-jun、c-fos mRNA均呈陽性表達。c-fos和c-jun是細胞的早期反應基因，屬即刻早基因(immediate early genes，IEG)家族。IEG的特點是對外界刺激的快速誘導性，對神經(jīng)遞質、激素、神經(jīng)沖動及外界刺激可在數(shù)分鐘內作出反應，并進行表達。在哺乳動物中，F(xiàn)OS 家族(c-Fos、FosB、Fra-1、Fra-2)和 JUN 家族(c-Jun、JunB、JunD)共同組成激活蛋白1(activator protein-1，AP-1)，AP-1以同源(JUN-JUN)或異源二聚體(FOS-JUN)的形式發(fā)揮作用。生理條件下，細胞中AP-1以同源二聚體為主發(fā)揮作用，活性表達很低，當細胞受到生理和病理因素刺激時，如細胞因子、感染、致癌劑等刺激時，AP-1將以異源二聚體為主發(fā)揮作用，其表達水平及活性明顯增加［7-8］。c-fos與 cjun的表達是偶聯(lián)的，c-fos、c-jun蛋白必須結合，共同介導目的基因的表達。當神經(jīng)細胞受到外界刺激后，興奮性氨基酸或NMDA受體等第一信使被激活，導致CaM、Ca2+、IP3、cAMP等第二信使表達并進入細胞核，誘導 c-fos/c-jun的轉錄和翻譯，翻譯出的Fos和Jun蛋白進入細胞核內并形成異源二聚體Fos-Jun復合物，與基因中的AP-1調節(jié)位點緊密結合并激活靶基因，使神經(jīng)元結構與功能受到損害［9-10］。RIRI激活細胞內信號轉導途徑，c-fos和 cjun的產物Fos、Jun蛋白聯(lián)合為Fos-Jun二聚體，即轉錄因子AP-1特異性與DNA上AP-1結合位點結合，啟動后期效應基因的轉錄，從而促進細胞解體、凋亡［11-12］。

BMSC可在一定條件下分化成為神經(jīng)元樣細胞，并有向病灶趨化的特性［13］，適合于再生醫(yī)學，對中樞系統(tǒng)的再生具有重要的作用［14］;此外因其取材簡單，來源較廣泛，易于體外擴增等特點。Zhang等［15］研究發(fā)現(xiàn)BMSC移植可抑制視網(wǎng)膜光感受器細胞凋亡，從而降低視網(wǎng)膜的損傷。本實驗通過建立RIRI模型，玻璃體腔注射BMSC，研究發(fā)現(xiàn) BMSC組再灌注后各時間點c-fos/c-jun的陽性表達低于模型組，其中再灌注后 1 h、6 h、12 h、24 h、48 h 兩組差異均具有統(tǒng)計學意義(均為P＜0.05)。本實驗證實了 cfos、c-jun基因在RIRI中可激活AP-1，誘導神經(jīng)節(jié)細胞凋亡壞死，從而使神經(jīng)元細胞在結構及功能上受到長時間的損害，玻璃體腔注射BMSC可明顯抑制c-fos、c-jun的陽性表達，減少 RIRI中神經(jīng)節(jié)細胞損傷，使視網(wǎng)膜得到保護，從而起到治療作用，提示BMSC對RIRI有保護治療作用，為BMSC治療RIRI提供了新的前景。

1 Perlman JI，McCole SM，Pulluru P，Chang CJ，Lam TT，Tso MO.Disturbances in the distribution of neurotransmiters in the rat retina after ischemia［J］.Curr Eye Res，1996，15(6):589-596.

2 Yan L，Li SY，Mu XL.Culture and biological characteristics of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in SD rats［J］.Shiyong Yixue Zazhi，2008，24(17):2945-2947.

3 Gehlbach PL，Purple RL.A paired comparison of two models of experimental retinal ischemia ［J］.Curr Eye Res，1994，13(8):597-602.

4 Tsujikawa A，Ogura Y，Hiroshiba N，Miyamoto K，Kiryu J，Tojo SJ，et al.Retinal ischemia-reperfusion injury attenuated by blocking of adhesion molecules of vascular endothelial［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1999，40(6):1183-1190.

5 Zhang Y，Cho CH，Atchaneeyasakul LO，McFarland T，Appukutan B，Stout JT.Activation of the mitochondrial apoptotic pathway in a rat model of central retinal artery occlusion［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2005，46(6):2133-2139.

6 Otori Y，Shimada S，Morimura H，Tshimoto I，Tohyama M，Tano Y.Expression of c-fos and c-jun mRNA following transient retinal ischemia:an approach using ligation of the retinal central artery in the rat［J］.Surv Ophthalmol，1997，42(1):96-104.

7 Verde P，Casalino L，Talotta F，Yaniv M，Weitzman JB.Decipheirng AP-1 function in tumorigenesis［J］.Cell Cycle，2007，6(21):2633-2639.

8 Malnou CE，Brockly F，F(xiàn)avard C，Moquet-Torcy G，Piechaczyk M，Jariel-Encontre I.Heterodimerization with different jun proteins controls cfos intranuclear dynamics and distribution［J］.J Biol Chem，2010，285(9):6552-6562.

9 Miyamoto E.Molecular mechanism of neuronal plasticity:induetion and maintenance of long-term potentiation in the hippocampus［J］.Pharmacol Sci，2006，100(5):433-442.

10 Kubik S，Miyashita T，Guzowski JF.Using immediate-early genes to map hippoeampal subregional functions［J］.Learn Memo，2007，14(11):758-770.

11 Estus S，Zaks WJ，F(xiàn)reeman RS，Gruda M，Bravo R，Johnson EM.Altered gene expression in neurons during programmed cell death:identification of c-jun as necessary for neuronal apoptosis［J］.J Cell Biol，1994，127(6):1717-1727.

12 Whitfield J，Neame SJ，Paquet L，Paquet L，Bernard O，Ham J.Dominant-negative c-jun promotes neuronal survival by reducing BIM expression and inhibiting mitochondrial cytochrome C release［J］.Neuron，2001，29(3):629-643.

13 Li N，Li XR，Yuan JQ.Effects of bone-marrow mesenchymal stem cells transplanted into vitreous cavity of rat injured by ischemia/reperfusion［J］.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol，2009，247(4):503-514.

14 Derubeis AR，Cancedda R.Bone marrow stromal cells(BMSCs)in bone engineering:limitations and recent advances［J］.Ann Biomed Eng，2004，32(1):160-165.

15 Zhang Y，Wang W.Effects of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on light-damaged retina［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2010，51(7):3742-3748.