曹霞 姜曉璇 唐永贏 馬林昆 周媛

外傷性視神經(jīng)損傷模型主要包括橫斷傷、擠壓傷、牽拉傷、鉗夾傷、撞擊傷等模型。其中視神經(jīng)鉗夾傷損傷模型目前應(yīng)用較廣，與臨床上視神經(jīng)挫傷最為接近。建模后不同時(shí)間點(diǎn)視神經(jīng)損傷的形態(tài)學(xué)變化通過動(dòng)物處死后獲取的組織切片進(jìn)行觀察，限制了長期、全面的縱向研究。如何在保證動(dòng)物存活的前提下，較為準(zhǔn)確地判斷建模后不同時(shí)間點(diǎn)視神經(jīng)的損傷狀況是當(dāng)前亟待解決的問題。核磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)能對(duì)神經(jīng)損傷的狀況進(jìn)行檢測(cè)，是臨床上常用的影像學(xué)檢查方法［1-2］。而視神經(jīng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，使用MRI掃描活體動(dòng)物(如大鼠)損傷的視神經(jīng)，是否能較為直觀地觀察到視神經(jīng)損傷及其周圍相關(guān)組織的變化情況呢?為此，我們?cè)阢Q夾傷損傷模型建立后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠視神經(jīng)進(jìn)行MRI掃描，并結(jié)合組織病理切片HE染色結(jié)果進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 成年SPF級(jí)SD大鼠36只，雌性，體質(zhì)量190～210 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下常規(guī)飼料喂養(yǎng)，動(dòng)物使用遵循ARVO聲明。觀察大鼠雙眼外眼正常，檢查雙眼屈光間質(zhì)清，瞳孔等大等圓，對(duì)光反射靈敏，眼底檢查無異常。將雙眼正常的大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(30只)和對(duì)照組(6只)。

1.2 方法

1.2.1 建立視神經(jīng)鉗夾傷模型 實(shí)驗(yàn)組SD大鼠腹腔注射100 g·L－1水合氯醛(每只大鼠按體質(zhì)量注射4 mL·kg－1)，麻醉滿意后將大鼠取右側(cè)臥位置于手術(shù)顯微鏡下，以左眼為手術(shù)眼，右眼為自身對(duì)照眼。剪開左眼外眥約2 mm，環(huán)形剪開左眼球結(jié)膜，避開大血管，向后鈍性分離外直肌，提起球結(jié)膜向前稍牽拉眼球，暴露視神經(jīng)3～4 mm，用夾持力為50 g的夾持鉗在球后約2 mm處鉗夾視神經(jīng)10 s，避免損傷血管，制成視神經(jīng)鉗夾傷模型。鉗夾完成后將眼球小心恢復(fù)原位，氯霉素眼液及紅霉素眼膏敷眼，待大鼠蘇醒后放回籠內(nèi)。第2天觀察術(shù)眼，術(shù)眼無感染、瞳孔散大、直接對(duì)光反射消失、眼球無明顯突出為造模成功。對(duì)照組不做任何處理。

1.2.2 大鼠視神經(jīng)MRI掃描 實(shí)驗(yàn)組在術(shù)后3 d、5 d、7 d、14 d、60 d 分別取 6 只大鼠，與對(duì)照組大鼠(6只)行視神經(jīng) MRI掃描(Siemens Avanto I Class 1.5 T磁共振成像儀)。將大鼠固定在動(dòng)物線圈(上海晨光動(dòng)物專用掃描線圈)，并局部保溫采集 MRI圖像。先以矢狀位圖像定位，在大腦皮層、小腦上緣做一條水平線;然后在嗅腦前方再做一條斜線，與水平線形成35°夾角。按照此方位進(jìn)行斜橫斷位掃描，成像序列為T2加權(quán)成像(T2WI)，掃描參數(shù):重復(fù)時(shí)間2500 ms，回波時(shí)間65 ms，層厚2 mm，成像視野89 mm×89 mm。觀察損傷側(cè)視神經(jīng)有無增粗水腫及后方軟組織情況。

1.2.3 視神經(jīng)和視網(wǎng)膜石蠟切片及 HE染色 對(duì)照組大鼠及實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)大鼠行MRI掃描后，分別腹腔注射100 g·L－1水合氯醛過量麻醉(每只大鼠注射量≥9 mL)處死，快速摘除術(shù)側(cè)及對(duì)側(cè)眼球，并保留球后視神經(jīng)5 mm左右，40 g·L－1多聚甲醛固定液固定24 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片后，組織切片脫蠟、水化，進(jìn)行 HE染色，光鏡下觀察視神經(jīng)及視網(wǎng)膜各層損傷情況。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠視神經(jīng)MRI檢查結(jié)果 對(duì)照組大鼠MRI檢查結(jié)果顯示，雙側(cè)視神經(jīng)粗細(xì)均勻，周圍無明顯病變信號(hào)影。實(shí)驗(yàn)組大鼠MRI掃描結(jié)果均出現(xiàn)變化:損傷后3 d，損傷側(cè)視神經(jīng)球后段橫行小條片狀高信號(hào)影，多為創(chuàng)傷后的神經(jīng)水腫所致，周圍組織也有相應(yīng)的水腫改變，且隨時(shí)間變化進(jìn)行性加重;損傷后7 d，損傷側(cè)視神經(jīng)高信號(hào)影，左側(cè)外直肌也有水腫改變;損傷后2個(gè)月，大鼠損傷側(cè)視神經(jīng)球后段萎縮，和對(duì)照組視神經(jīng)相比，損傷側(cè)視神經(jīng)有較明顯變細(xì)，近眼球后方也見少量高信號(hào)影，考慮為少量積液引起。

2.2 各組視神經(jīng)HE染色結(jié)果 對(duì)照組大鼠視神經(jīng)縱切片神經(jīng)纖維排列密集、規(guī)則，染色均勻，少量膠質(zhì)細(xì)胞均勻分布(圖1A)。實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)大鼠損傷后均出現(xiàn)相應(yīng)病變:損傷后3 d，實(shí)驗(yàn)組大鼠視神經(jīng)纖維水腫，膠質(zhì)細(xì)胞排列紊亂，中心可見梗死灶(圖1B);損傷后5 d，視神經(jīng)出現(xiàn)大量空泡變性，神經(jīng)纖維稀疏，梗死灶擴(kuò)大，膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯(圖1C);損傷后7 d，神經(jīng)空泡變性嚴(yán)重，神經(jīng)纖維稀疏，膠質(zhì)細(xì)胞增生，脫髓鞘區(qū)神經(jīng)纖維更加疏松，細(xì)胞核不規(guī)則、密集排列，偶爾可見有典型血管內(nèi)皮細(xì)胞的新生血管芽(圖1D);損傷后14 d，神經(jīng)纖維和膠質(zhì)細(xì)胞潰變結(jié)構(gòu)模糊，梗死灶內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞增生，纖維組織相對(duì)增多，損傷區(qū)可見多處新生血管及少量小膠質(zhì)細(xì)胞(圖1E);損傷后2個(gè)月，神經(jīng)纖維增生，膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目明顯減少，和對(duì)照組相比損傷側(cè)視神經(jīng)出現(xiàn)明顯萎縮(圖1F)。

2.3 各組視網(wǎng)膜HE染色結(jié)果 對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜層次清晰，節(jié)細(xì)胞呈單層排列，整齊密集，胞核清楚，核膜光滑完整，視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(retinal nerve fiber layer，RNFL)厚度均勻(圖2A)。實(shí)驗(yàn)組大鼠損傷后視網(wǎng)膜均出現(xiàn)相應(yīng)病變:損傷后3 d，RNFL水腫增厚，出現(xiàn)空泡，部分RGC出現(xiàn)核固縮，染色加深，排列稀疏(圖2B);損傷后5 d，RNFL水腫減輕，RGC層出現(xiàn)核固縮和空泡(圖2C);損傷后7 d，RNFL水腫減輕，RGC層核固縮明顯，排列稀疏，視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)明顯變薄(圖2D);損傷后14 d，RNFL結(jié)構(gòu)仍顯疏松，隨時(shí)間進(jìn)行性加重(圖2E);損傷后2個(gè)月，RNFL層無明顯水腫，RGC層仍存在核固縮與壞死(圖2F)。

Figure 1 HE staining of optic nerve.A:Control group;B:3 days after injury;C:5 days after injury;D:7 days after injury;E:14 days after injury;F:2 months after injury 視神經(jīng)HE染色結(jié)果。A:對(duì)照組;B:實(shí)驗(yàn)組損傷后3 d;C:實(shí)驗(yàn)組損傷后5 d;D:實(shí)驗(yàn)組損傷后7 d;E:實(shí)驗(yàn)組損傷后14 d;F:實(shí)驗(yàn)組損傷后2個(gè)月

Figure 2 HE staining of retina.A:Control group;B:3 days after injury;C:5 days after injury;D:7 days after injury;E:14 days after injury;F:2 months after injury 視網(wǎng)膜HE染色結(jié)果。A:對(duì)照組;B:實(shí)驗(yàn)組損傷后3 d;C:實(shí)驗(yàn)組損傷后5 d;D:實(shí)驗(yàn)組損傷后7 d;E:實(shí)驗(yàn)組損傷后14 d;F:實(shí)驗(yàn)組損傷后2個(gè)月

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選用的體質(zhì)量190～210 g的大鼠，視神經(jīng)直徑約為 0.64 mm，和人類結(jié)構(gòu)相似［3］。且鉗夾傷模型便于操作，不僅能很好地保持視神經(jīng)外膜的完整性，而且能部分定量。我們使用了50 g的反式夾持鑷在球后2 mm處夾持10 s，從病理切片MRI掃描與HE染色結(jié)果來看，實(shí)驗(yàn)組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只大鼠都出現(xiàn)明顯的損傷變化，且損傷及修復(fù)過程都存在一定規(guī)律:損傷后3－7 d時(shí)，視神經(jīng)腫脹，出現(xiàn)大量空泡變性，神經(jīng)纖維稀疏，膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯，視網(wǎng)膜RNFL水腫明顯，RGC層出現(xiàn)核固縮和空泡;損傷后14 d，損傷改變逐漸穩(wěn)定，梗死灶內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞增生，纖維組織相對(duì)增多，RNFL結(jié)構(gòu)仍顯疏松;損傷后2個(gè)月，可見夾持部位視神經(jīng)萎縮，神經(jīng)纖維增生，膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目明顯減少，RNFL層無明顯水腫，RGC層仍存在核固縮與壞死。各時(shí)間點(diǎn)連續(xù)性好，變化趨勢(shì)明顯。說明我們采用的固定壓力鉗夾法能建立穩(wěn)定的大鼠視神經(jīng)損傷模型，可觀察到隨時(shí)間變化的視神經(jīng)及視網(wǎng)膜細(xì)胞病理改變特點(diǎn)。

目前對(duì)活體動(dòng)物視神經(jīng)損傷情況判斷方法并不一致，孔祥梅等［4］于自然光線狀態(tài)下，在眼球前 5 mm用測(cè)微鋼尺測(cè)瞳孔大小。然后于立式照明燈前10 cm處，從右上方照射瞳孔，觀察瞳孔對(duì)光反應(yīng)。通過對(duì)光反射時(shí)活體動(dòng)物瞳孔的變化來判斷視力損傷情況，但該方法直觀性不強(qiáng)，缺乏統(tǒng)一的判斷標(biāo)準(zhǔn)。Lagrèze等［5］對(duì)視神經(jīng)損傷患者進(jìn)行 MRI掃描發(fā)現(xiàn)，MRI能較好地反映視神經(jīng)的腫脹及損傷狀況。顏華等［6］使用 MRI對(duì)液壓沖擊顱腦損傷法導(dǎo)致的視神經(jīng)損傷進(jìn)行掃描，但未對(duì)各時(shí)間點(diǎn)損傷情況進(jìn)行詳細(xì)比較分析。我們?cè)趯?duì)大鼠進(jìn)行MRI掃描時(shí)，采用成像序列T2WI水平位掃描，在周圍脂肪襯托下可顯示視神經(jīng)眶內(nèi)段及顱內(nèi)段，能較好地觀察到視神經(jīng)及眼眶內(nèi)的眼外肌、球后脂肪等周圍結(jié)構(gòu)的變化情況。

MRI掃描及相應(yīng)病理切片檢查結(jié)果顯示，損傷后3 d時(shí)，MRI掃描結(jié)果出現(xiàn)左側(cè)視神經(jīng)球后段橫行小條片狀高信號(hào)影，可能為創(chuàng)傷后引起的神經(jīng)水腫所致，而光鏡下也能觀察到視神經(jīng)纖維出現(xiàn)水腫;損傷后7 d時(shí)，仍可觀察到左側(cè)視神經(jīng)損傷部位信號(hào)增高，病理切片可見神經(jīng)空泡變性嚴(yán)重，神經(jīng)纖維稀疏;損傷后2個(gè)月，MRI掃描可觀察到損傷側(cè)視神經(jīng)球后段萎縮，病理切片也可觀察到此時(shí)神經(jīng)纖維增生，瘢痕形成，膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目明顯減少?？梢娫诒緦?shí)驗(yàn)中，通過MRI掃描觀察到視神經(jīng)損傷后3 d后即出現(xiàn)明顯腫脹及信號(hào)改變，且隨時(shí)間延長進(jìn)行性加重，損傷2個(gè)月后可觀察到明顯的視神經(jīng)萎縮，與組織學(xué)切片中HE染色顯示的視神經(jīng)和視網(wǎng)膜細(xì)胞變化趨勢(shì)相符，也與之前的研究結(jié)果基本一致［7-9］。根據(jù)我們的研究結(jié)果可初步判定:MRI可用于判斷活體大鼠視神經(jīng)夾持傷模型建模是否成功，作為創(chuàng)傷后視神經(jīng)水腫、后期視神經(jīng)萎縮的輔助判斷，具有一定的研究價(jià)值和臨床應(yīng)用潛力。

然而MRI掃描僅能初步判斷視神經(jīng)損傷修復(fù)情況，無法清晰地反映視神經(jīng)損傷程度及軸索信號(hào)轉(zhuǎn)運(yùn)情況。有研究表明［10-11］，Mn2+能使 MRI的 T1弛豫時(shí)間縮短，且半徑與鈣離子相近，能通過鈣離子通道進(jìn)入可興奮細(xì)胞的內(nèi)部，在神經(jīng)元中可沿軸突順行轉(zhuǎn)運(yùn)。故如果在實(shí)驗(yàn)中采用Mn2+為示蹤劑進(jìn)行MRI神經(jīng)纖維束追蹤，可以更好地反映出視神經(jīng)的損傷狀況。下一步實(shí)驗(yàn)中，可以采用 Mn2+增強(qiáng)型MRI對(duì)損傷視神經(jīng)進(jìn)行掃描，觀察活體大鼠視神經(jīng)損傷的表現(xiàn)，進(jìn)一步了解視神經(jīng)內(nèi)軸索轉(zhuǎn)運(yùn)的情況。

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