楊小嬌 郁金紅

除酶法(EIA)外，抗-HCV的檢測(cè)一般采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析(CMIA)和電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)。但孕婦和腎病或類風(fēng)濕疾病患者采用這些篩查方法易受到假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果的限制，需要進(jìn)行補(bǔ)充或驗(yàn)證性測(cè)試，特別是對(duì)于較低HCV流行率的人群?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)方法檢測(cè)HCV-cAg能區(qū)分現(xiàn)癥和過(guò)去感染，針對(duì)感染6～8周的患者有較高靈敏度。此外，PCR和免疫印跡法(RIBA)的檢查是必要的，尤其是當(dāng)HCV RNA陰性時(shí)，可以做RIBA 實(shí)驗(yàn)，區(qū)分既往感染還是假陽(yáng)性，有利于流行病學(xué)調(diào)查。美國(guó)CDC建議以適當(dāng)?shù)男盘?hào)截止閾值樣本/cut-off比率(S/CO)作為抗-HCV確認(rèn)，以限制需要做補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)的樣本數(shù)量，化學(xué)發(fā)光法推薦為1.0～8.0，ELISA推薦為1.0～3.8[1-3]。本研究重點(diǎn)分析臨床檢測(cè)中不常見(jiàn)的低值，CMIA法檢測(cè)值在0.40～10.0，比較了不同方法的敏感度，影響因素，排除假陽(yáng)性和不確定標(biāo)本，重新設(shè)置較準(zhǔn)確的截?cái)嘀?，同時(shí)分析HCV-Ag和HCV RNA關(guān)系。

資料與方法

一、研究對(duì)象

2015年9月至2016年12月南京市第二醫(yī)院就診的門診HCV感染患者。CMIA檢測(cè)31例(S/CO ratio 0.40～10.0 )，33例(S/CO ratio>10.0)和20例(S/CO ratio<0.4)，所有樣本血清儲(chǔ)存在-20 ℃。

二、試劑

HCV抗體和抗原定量測(cè)定試劑盒由雅培貿(mào)易(上海)有限公司提供。HCV抗體定性測(cè)定試劑盒由北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司提供，HCV RNA定量試劑盒由凱杰生物工程(深圳)有限公司提供，HCV RNA>500拷貝/mL為陽(yáng)性。RIBA 實(shí)驗(yàn)3.0 條狀免疫印跡分析，美國(guó)全球奇隆公司提供試劑盒。其余檢查項(xiàng)目外送。同時(shí)檢測(cè)質(zhì)控品。

三、方法

采用ELISA、CMIA、ECLIA檢測(cè)抗-HCV，熒光定量RT-PCR法檢測(cè)HCV RNA，RIBA法做HCV確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，CMIA法檢測(cè)HCV-Ag。

四、統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件繪制受試者工作特征曲線并計(jì)算抗-HCV和HCV-Ag閾值。用線性回歸計(jì)算相關(guān)性。

結(jié) 果

一、比較不同方法檢測(cè)低值HCV標(biāo)本

如表1所示，用CMIA法測(cè)31份低值抗-HCV(S/CO 0.40～10.0)標(biāo)本中，用RIBA測(cè)定25.81%有反應(yīng)，29.03%無(wú)反應(yīng)，45.16%不確定。排除不確定結(jié)果的樣本，CMIA 和ECLIA兩者比較中有52.94%檢查不一致，CMIA法假陽(yáng)性率約為29.41%，假陰性率為5.88%，這31份低值標(biāo)本病毒定量均是陰性。在不確定的標(biāo)本中有1份RF值、IgG升高，1份IgA升高。

表1 CMIA法測(cè)抗-HCV(S/CO值在0.40～10.0)時(shí)不同方法檢測(cè)HCV結(jié)果

續(xù)表1

二、ROC曲線分析ECLIA、CMIA、HCV-Ag 和HCV RNA診斷HCV效能

如表 2, 表3和圖1，除去RIBA檢測(cè)結(jié)果為不確定標(biāo)本和血不夠沒(méi)測(cè)標(biāo)本，S/CO值為0.40～10.0有13份，0.00～0.30有19份，11.0～19.0有32份，總共64份樣本制作ROC曲線。ECLIA曲線下面積為1.000(95%CI：0.000～1.000)、CMIA 0.997(95%CI：0.000～1.000)、HCV-Ag曲線下面積為0.753(95%CI：0.636～0.870)和HCV RNA曲線下面積為0.679(95%CI：0.551～0.808)。

表2 CMIA法測(cè)抗-HCVS/CO 值在0.00～0.30時(shí)不同方法檢測(cè)HCV結(jié)果

表3 CMIA法測(cè)抗-HCVS/CO 值在11.0～19.0時(shí)不同方法檢測(cè)HCV結(jié)果

圖1 ECLIA(HCV Ab)、CMIA(HCV Ab)、HCV-Ag和HCV-RNA的ROC曲線

當(dāng)敏感度和特異度達(dá)最大時(shí)：ECLIA、CMIA、HCV-Ag 和HCV RNA閾值分別是 15.85 COI, 3.31 S/CO, 3.32 fmol/L和3.94E+03拷貝/mL。

三、HCV RNA和HCV Ag的相關(guān)性

64例樣本中, HCV RNA陰性的樣本沒(méi)有HCV-Ag的反應(yīng)。16例HCV-Ag>3 fmol/L，HCV RNA為3.10E+04～1.80E+08 IU/mL。5例HCV-Ag陽(yáng)性、HCV RNA陰性，回歸分析HCV RNA和HCV Ag的相關(guān)性R2 為0.91 (斜率=0.6855, 截距=1.6199)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)。

四、RIBA結(jié)果

RIBA方法檢測(cè)84份樣本，28份(33.3%)為陰性，40份(47.6%)為陽(yáng)性，16份(19%)為不確定。40份RIBA陽(yáng)性的結(jié)果中，97.5%顯示 core 和NS3抗原陽(yáng)性，37.5%顯示NS4-1和NS5抗原陽(yáng)性，只有2.5%顯示 NS4-2陽(yáng)性。16份不確定標(biāo)本中分別與Core (43.8%) 和NS3 (56.2%)反應(yīng)。NS4 和NS5均沒(méi)有反應(yīng)。

討 論

2013年美國(guó)不再推薦RIBA方法。但是類似的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)INNO-LIA方法在歐洲應(yīng)用，對(duì)于沒(méi)有開(kāi)展HCV RNA檢測(cè)的單位，可以參考RIBA的結(jié)果[4]。流行病學(xué)調(diào)查需要對(duì)于抗HCV陽(yáng)性、HCV RNA陰性的患者，通過(guò)RIBA實(shí)驗(yàn)區(qū)分是既往感染還是假陽(yáng)性，其中低值抗-HCV樣本最難區(qū)分。有報(bào)道477份抗體陽(yáng)性的標(biāo)本，RIBA實(shí)驗(yàn)68%真陽(yáng)性，22%假陽(yáng)性，10%不確定[5]。這些假陽(yáng)性結(jié)果可能與RF有關(guān)，RF可能與免疫球蛋白、腎病綜合征、肝病和其他病毒或寄生蟲(chóng)感染存在交叉反應(yīng)。本研究中，抗HCV低值時(shí)，有約四分之一是既往感染，有一半是不確定的。除去不確定的樣本，有約近三分之一是假陽(yáng)性，不確定樣本中有2個(gè)樣品可能受到RF或IgG或IgA的影響。CMIA 和ECLIA兩者比較中有52.94%不一致。雖然生物素酶聯(lián)免疫吸附法第三代比第四代具有更高的特異性，CMIA與ELISA結(jié)果也有33.3%不一致。ELISA法抗HCV假陽(yáng)性率為39.42%， S/CO> 3.8時(shí)陽(yáng)性率為98.5%，1 < S/CO < 3.8時(shí)陽(yáng)性率僅為30%，有報(bào)道為26%[6]。

在39個(gè)陽(yáng)性樣品測(cè)試通過(guò)RIBA，HCV-Ag值較低的樣本，用ECLIA法時(shí)有較高的抗-HCV值。其中一個(gè)原因可能與ECLIA的檢測(cè)范圍更廣有關(guān)，另一個(gè)原因可能是患者在HCV感染急性期，HCV-Ag較高，抗-HCV較低；當(dāng)處于恢復(fù)期或慢性期時(shí)，抗-HCV呈下降趨勢(shì)，而HCV Ab呈穩(wěn)定上升趨勢(shì)。雅培HCVAg和羅氏HCV RNA兩種方法具有較高的相關(guān)性，這一結(jié)果與其他報(bào)告相似[7, 8]。CMIA法較ELISA法更靈敏，HCV基因分型不影響抗原和病毒載量的正相關(guān)。

根據(jù)ROC曲線，ECLIA和CMIA的準(zhǔn)確率較高，HCV RNA的準(zhǔn)確率最低。主要原因是HCV RNA是病毒復(fù)制的指標(biāo)，不能反映既往感染情況。HCV-Ag的cut-off值與說(shuō)明書(shū)推薦的基本一致， ECLIA(15.85 COI)、CMIA(3.31 S/CO)和HCV RNA(3.94E+03拷貝/mL)的值均高于本實(shí)驗(yàn)室參考值，推薦這些值作為實(shí)驗(yàn)室參考，可以帶來(lái)較高的診斷準(zhǔn)確性和特異性。否則，閾值設(shè)置為S/CO比值≥1，快速篩查ECLIA或CMIA抗HCV試驗(yàn)可能產(chǎn)生較多的假陽(yáng)性結(jié)果。有報(bào)道建議ECLIA法截?cái)嘀禐?2.27[9]。為了確認(rèn)HCV暴露，另一項(xiàng)研究報(bào)告稱，S/CO比值在3.0到19.9之間的樣本應(yīng)進(jìn)行RIBA隨訪，除非進(jìn)行PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性[10]。S/CO比值設(shè)置成10.3是提高HCV感染診斷準(zhǔn)確性的閾值[11]。

在RIBA檢測(cè)中，硝基膜上的包裝抗原來(lái)自HCV合成抗原(Core, NS4-1, NS4-2, NS5)和大腸桿菌表達(dá)重組蛋白抗原NS3。對(duì)于RIBA不確定的樣本，抗-Core反應(yīng)活性主要與在感染恢復(fù)后抗HCV濃度逐漸下降有關(guān)，其目的是檢測(cè)特定的細(xì)胞免疫記憶對(duì)HCV的反應(yīng)，作為之前與病毒接觸的反應(yīng)。另一個(gè)可能的原因是Core和NS3表現(xiàn)出優(yōu)先的抗原表達(dá)，而NS4和NS5表現(xiàn)較低是非優(yōu)勢(shì)抗原。化學(xué)發(fā)光微粒子免疫測(cè)定通過(guò)檢測(cè)HCV基因組中候選結(jié)構(gòu)蛋白抗體C(核心區(qū)第1至150個(gè)氨基酸)和非結(jié)構(gòu)蛋白抗體(NS3、NS4)。該方法覆蓋了整個(gè)HCV基因組，對(duì)于定性檢測(cè)HCV是有效的，敏感性有顯著提高。Cobas是通過(guò)利用核心NS3和NS4蛋白肽的表達(dá)及重組抗原檢測(cè)抗HCV，而ELISA板上覆蓋重組HCV基因的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)段?？梢?jiàn)，雖然選擇的大多數(shù)試劑都含有NS3區(qū)和核心區(qū)，但在包被或合成抗原的過(guò)程、抗原純度和載體的選擇仍有許多差異。

綜上所述，通過(guò)對(duì)幾種HCV診斷方法的綜合分析，低水平的抗HCV更需謹(jǐn)慎分析。假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果會(huì)給臨床和患者錯(cuò)誤的提示，耽誤治療。因此不能盲目相信儀器的結(jié)果，對(duì)有疑問(wèn)的應(yīng)結(jié)合病史和臨床其他檢查來(lái)判斷，必要時(shí)重新復(fù)查，然后做確認(rèn)實(shí)驗(yàn)或核酸檢測(cè)。