焦玉 胡然

海藻消瘤膠囊處方為湖北省中醫(yī)名師內(nèi)分泌科專家胡思榮主任醫(yī)師集多年臨床經(jīng)驗(yàn)，自擬所得。全方以軟堅(jiān)散結(jié)，祛瘀通絡(luò)治其標(biāo)，疏肝解郁，消痰祛濕治其本，由海藻、昆布、浙貝母、土鱉蟲、制鱉甲、生牡蠣、三棱、莪術(shù)、桃仁、白花蛇舌草、半枝蓮、夏枯草、黃柏、川厚樸、白芍藥、延胡索、金銀花、陳皮、焦山楂、茯苓、生甘草組成。功效軟堅(jiān)散結(jié)，化痰消瘤，祛瘀通脈，用于乳腺增生、甲狀腺瘤。為控制該制劑的質(zhì)量，更好的應(yīng)用于臨床，對(duì)其進(jìn)行了質(zhì)量控制方法研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料(1)處方:海藻、昆布、浙貝母、土鱉蟲、制鱉甲、生牡蠣、三棱、莪術(shù)、桃仁、白花蛇舌草、半枝蓮、夏枯草、川厚樸、黃柏、白芍藥、延胡索、金銀花、陳皮、焦山楂、茯苓、生甘草。(2)制備工藝:將處方量藥材浸泡半小時(shí)后，加10 倍量水煎煮2 次，2 h/次，濾過(guò)，合并濾液，濃縮成浸膏，加淀粉適量，混勻，于60℃干燥后，粉碎，過(guò)80 目篩，整粒，分裝，即得。

1.2 儀器與試藥

1.2.1 儀器:高效液相色譜儀(2910 泵，2930UV 檢測(cè)器，N2000 工作站，上海天普精密科學(xué)儀器有限公司);C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，江蘇漢邦科技有限公司);ZF-1 三用紫外分析儀(上海顧村光電儀器廠)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，TG328A 型光學(xué)讀數(shù)分析天平(湘儀天平儀器廠)。

1.2.2 試藥:①材料:聚酰胺薄膜(規(guī)格:10 cm×10 cm，浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠)。②試劑:甲醇、乙腈(色譜級(jí)，天津市大茂化學(xué)試劑廠)，注射用水(四川科倫藥業(yè)股份有限公司)。甲醇(分析純，西隴化工股份有限公司)，乙酸乙酯(分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司)，氨水(分析純，襄樊市樊城福利化工廠)，蒸餾水(自制)。③藥品:三批海藻消瘤膠囊樣品(規(guī) 格:0.26 g/粒，批號(hào):20120706、20130122、20130208)。貝母素甲對(duì)照品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定院，批號(hào):110750-200609)，貝母素乙對(duì)照品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定院，批號(hào):110751-200709)，橙皮苷對(duì)照品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定院，批號(hào):0721-200010)，柚皮苷對(duì)照品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定院，批號(hào):110722-200610)，綠原酸對(duì)照品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定院，批號(hào):110753-200413)，鹽酸小檗堿對(duì)照品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定院，批號(hào):110713-200911，純度86.8%)。缺浙貝母、金銀花、陳皮和黃柏的陰性對(duì)照分別按制法自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 浙貝母的薄層鑒別:取本品10 g，加水30 ml，加熱使溶解，放至室溫，加濃氨試液調(diào)pH 值至11 ～12，用二氯甲烷振搖提取2 次，40 ml/次，合并二氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇1 ml 使溶解，作為供試品溶液。另取貝母素甲、貝母素乙對(duì)照品，加無(wú)水乙醇制成每1 毫升各含2 mg 的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010 年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液(17∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。斑點(diǎn)分離度好，缺浙貝母的陰性樣品無(wú)干擾。薄層色譜圖見圖1。

2.1.2 金銀花的薄層鑒別:取本品5 g，加甲醇50 ml，加熱回流30 min，放冷，濾過(guò)，蒸干，殘?jiān)铀?0 ml 使搖提取2 次，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。另取綠原酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 毫升含1 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010 年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2 μl，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(6∶4∶3.5∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。缺金銀花的陰性樣品無(wú)干擾。薄層色譜圖見圖2。

圖1 海藻消瘤膠囊中浙貝母的薄層鑒別

圖2 海藻消瘤膠囊中金銀花的薄層鑒別

2.1.3 陳皮的薄層鑒別:取2.1.2 鑒別項(xiàng)下的供試品溶液，作為供試品溶液。取柚皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 ml 含1 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成過(guò)飽和溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010 年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2 μl，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷-丙酮-甲醇-冰醋酸(5∶1∶1∶0.02)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈(365 nm)下檢視。缺陳皮的陰性樣品無(wú)干擾。薄層色譜圖見圖3。

圖3 海藻消瘤膠囊中陳皮的薄層鑒別

2.2 黃柏中鹽酸小檗堿的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn):C18 色譜柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，ODS 預(yù)柱，流動(dòng)相:乙腈－0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3.0)(30∶70)，流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)∶270 nm，進(jìn)樣:20 μl，柱溫:室溫。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。拖尾因子小于1.05，主峰鹽酸小檗堿峰與雜質(zhì)峰的分離度大于1.5。

2.2.2 溶液的制備:①對(duì)照品溶液的制備:精密稱取鹽酸小檗堿峰對(duì)照品3.70 mg(純度86.8%)，置10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取該儲(chǔ)備液3 ～50 ml 量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成每1 毫升含19.27 μg 的溶液。②供試品溶液的制備:取本品，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸-甲醇(1∶100)混合溶液50 ml，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用鹽酸-甲醇溶液(1∶100)補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 專屬性試驗(yàn):將2.2.2 項(xiàng)下制備缺黃柏的陰性樣品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，陰性樣品溶液色譜圖在與對(duì)照品和供試品溶液色譜圖相同的保留時(shí)間未見鹽酸小檗堿色譜峰，表明陰性無(wú)干擾。對(duì)照品溶液、供試品溶液及缺黃柏的陰性樣品溶液色譜圖見4 ～6。

圖4 對(duì)照品色譜圖

圖5 海藻消瘤膠囊樣品色譜圖

圖6 缺黃柏的陰性樣品色譜圖

2.2.4 線性關(guān)系考察:精密吸取3.2.2 項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液10 ml，至50 ml 量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成每1 毫升含64.2 μg 的溶液。分別精密吸取該溶液1、2、4、6、8 ml 置10 ml 量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成進(jìn)樣 濃 度 為6.42、12.84、25.68、38.52、51.36、64.2 μg/ml的溶液，按3.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定鹽酸小檗堿峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到鹽酸小檗堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線y =18291x－12624，R2 =0.9991，結(jié)果表明鹽酸小檗堿在進(jìn)樣濃度6.42 ～64.2 μg/ml 范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積呈良好線性關(guān)系。見圖7。

2.2.5 精密度試驗(yàn):精密量取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液20 μl，注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣5 次。計(jì)算鹽酸小檗堿峰面積RSD 為0.51%，表明儀器精密度良好，見表1。

圖7 鹽酸小檗堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一批樣品(批號(hào):20120706)，按2.2.2 項(xiàng)下制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8 h 進(jìn)樣，測(cè)定鹽酸小檗堿峰面積，計(jì)算RSD 為0.80%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn):取同一批樣品(批號(hào):20120706)6 份按2.2.2 項(xiàng)下制備供試品溶液，進(jìn)樣，測(cè)定鹽酸小檗堿的峰面積，計(jì)算RSD 為0.98%，表明重復(fù)性良好。見表3。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn):精密稱取已知鹽酸小檗堿含量的樣品(批號(hào):20120816，含量為1.299 μg/g)0.25 g 6 份，置具塞錐形瓶中，并加入精密量取的鹽酸小檗堿對(duì)照品儲(chǔ)備液(濃度為38.52 μg/ml)10 ml，加甲醇至刻度，按2.2.2 項(xiàng)下制備供試品溶液，并按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。見表4。

表4 鹽酸小檗堿的回收率 n=6

2.3 樣品測(cè)定精密稱取三批樣品各0.5 g，按2.2.2項(xiàng)下制備供試品溶液，并按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算鹽酸小檗堿的含量。見表5。

表5 三批樣品中鹽酸小檗堿的含量

3 討論

海藻消瘤膠囊方選海藻、昆布、浙貝母、制鱉甲軟堅(jiān)散結(jié)，消痰祛濕;黃柏、夏枯草清熱散結(jié);柴胡、厚樸疏肝解郁，理氣止痛;神曲、焦山楂、茯苓健脾消食;黃芪、甘草補(bǔ)脾益氣，緩急止痛，調(diào)和諸藥，且甘草與海藻相反為用，因堅(jiān)積之病。非和平之藥所能取捷，必令其反伍而獲其功，取其相反相成之妙用。為控制該制劑的質(zhì)量，對(duì)方中的浙貝母、金銀花、陳皮進(jìn)行了鑒別，制劑中鹽酸小檗堿的含量進(jìn)行了測(cè)定。

浙貝母性微寒，味苦。清熱散結(jié)，化痰止咳。浙貝母中含多種甾體生物堿，如貝母素甲、貝母素乙、浙貝丙素、貝母新堿、貝母定堿、貝母替定堿等。其公認(rèn)的主要藥效成分為貝母素甲和貝母素乙，藥理作用明確，故以此為對(duì)照品鑒別方中藥味浙貝母。

陳皮中的主要成分為揮發(fā)油類、黃酮類等?！吨袊?guó)藥典》2010 年版一部中以橙皮苷為對(duì)照進(jìn)行鑒別，由于陳皮中也存在大量的柚皮苷成分，二者同為黃酮類化合物，因此一并作為鑒別的指標(biāo)。陳皮中的橙皮苷、柚皮苷和金銀花中的綠原酸均含有酚羥基，中等極性，因此供試品溶液制備過(guò)程中調(diào)酸后采用乙酸乙酯溶劑萃取，聚酰胺薄膜為吸附劑進(jìn)行鑒別。相比《中國(guó)藥典》中對(duì)于橙皮苷的鑒別采用硅膠G 吸附劑，二次展開的方法［1］，此鑒別方法更為簡(jiǎn)便，快速，準(zhǔn)確。

黃柏苦寒，清泄燥濕，善除下焦?jié)駸幔谔到Y(jié)祛除，為方中臣藥。鹽酸小檗堿為黃柏中的主要藥效成分，因此將其作為含量測(cè)定的指標(biāo)。方法學(xué)研究中，先后試驗(yàn)了流動(dòng)相乙腈－0.1%磷酸溶液(50:50)(每100毫升加十二烷基磺酸鈉0.1g)［1］、乙腈－0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3.0)(25∶75)［1］，發(fā)現(xiàn)后者流動(dòng)相系統(tǒng)組成下峰形好，柱壓較前者低，因此采用后者系統(tǒng)組成為流動(dòng)相。并對(duì)其比例進(jìn)行了優(yōu)化，最終采用乙腈－0.05 mol/L 磷酸二氫鈉溶液(磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3.0)(30 ∶70)，出峰時(shí)間適合，分離度好。

醫(yī)院驗(yàn)方大多根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)自擬總結(jié)得到，由此開發(fā)出的制劑密切結(jié)合臨床，品種多，規(guī)格齊，因此深受患者歡迎。該制劑所建立的質(zhì)量控制方法準(zhǔn)確、快速、重現(xiàn)性好，為不同制劑中含有相同藥味的制劑的質(zhì)量控制方法提供參考和借鑒。

1 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部).北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社.2010，176-177，286-287，1000-1001.