薛 峰 黃敏君 洪彩玲 楊英超 甘紹伯 谷俊朝

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院，北京熱帶醫(yī)學研究所，北京 100050； 2.熱帶病防治研究北京市重點實驗室，北京 100050; 3. 中國食品藥品檢定研究院，生物制品檢定所，寄生蟲疫苗室，北京 100050)

剛地弓形蟲Toxoplasmagondii是細胞內(nèi)寄生原蟲，可引起人獸共患弓形蟲病。我國人群平均感染率為4.0%～9.0%，孕婦感染率高達6.6%～32.9%(谷俊朝和甘紹伯，2008)。孕婦弓形蟲病可引發(fā)胎兒先天感染，導致流產(chǎn)、死胎、畸形、智力障礙等(Weissetal., 2009)。免疫力低下的病人，如器官移植和AIDS患者等，感染后可導致嚴重腦炎。弓形蟲感染早期臨床癥狀不明顯且特異性差，尚未有特異有效的藥物，所以及時準確的診斷方法和有效的疫苗對于該病防控和治療尤為重要(甘紹伯，2001)。目前，篩選免疫反應性較強的抗原并應用于改進免疫學診斷方法和疫苗研制仍是研究熱點(盧致民和張進順，2011)。

棒狀體蛋白(Rhoptry protein)是弓形蟲主要分泌抗原之一，在弓形蟲侵入宿主細胞時經(jīng)蟲體前端棒狀體釋放，參與納蟲泡(Parasitophorous vacuole，PV)形成和維穩(wěn)(Sibley, 2004)。我們先前通過生物素標記技術(shù)結(jié)合蛋白質(zhì)組學方法研究表明，ROP2蛋白是弓形蟲速殖子表達量最高的分泌蛋白(劉媛等，2013)。ROP2同源基因構(gòu)成一個較大的基因家族，包括ROP2、ROP4、ROP5、ROP7、ROP8、ROP18等棒狀體蛋白基因(El Hajjetal., 2006)。該家族蛋白在弓形蟲入侵宿主細胞早期均能分泌至納蟲泡膜(Parasitophorous vacuole membrane，PVM)?；蚯贸虺聊芯勘砻?，ROP2家族蛋白大多是弓形蟲重要的入侵和毒力作用因子，且往往具有酶活性(Sinaietal., 2001; Nakaaretal., 2003; Weilhammeretal., 2011)。另外，ROP2家族蛋白具有良好的免疫反應性和免疫保護性，對改進免疫學診斷方法和研制亞單位重組疫苗具有重要意義(Labesseetal., 2009; Gatkowskaetal., 2010)。

本研究克隆了弓形蟲RH株ROP2基因，構(gòu)建了全基因原核表達載體，在大腸桿菌工程菌中誘導表達了含GST和6×His標簽的融合重組蛋白，并采用免疫印跡實驗初步評價了rROP2的免疫反應性，為進一步研究基于弓形蟲棒狀體蛋白的免疫診斷方法，以及分泌蛋白與宿主細胞的相互作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1弓形蟲株系: 國際標準強毒株剛地弓形蟲RH株，由中國農(nóng)業(yè)大學國家動物寄生原蟲實驗室惠贈。本實驗室綠猴腎Vero細胞體外傳代速殖子保種。

1.1.2宿主細胞系: 非洲綠猴腎Vero細胞，購自中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學研究所基礎醫(yī)學細胞中心。

1.1.3載體和工程菌株: pET-41 Ek/LIC快速連接原核表達試劑盒購于Novagen公司，大腸桿菌NovaBlue測序菌株和RosettaTM(DE3) pLysS 工程菌株感受態(tài)由本實驗室制備。

1.1.4酶和相關試劑: DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Trizol試劑、Superscript III 逆轉(zhuǎn)錄酶購自Invitrogen公司。質(zhì)粒提取試劑盒、EX-Taq 高保真DNA聚合酶、pd(N)9逆轉(zhuǎn)錄隨機引物購自大連TaKaRa公司。ProteinaShow-G250蛋白快速染色試劑、高靈敏度化學發(fā)光檢測試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、IPTG、Western Midview Western中分子量蛋白Marker、以及BCA蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀生物技術(shù)有限公司。Anti-6×His tag小鼠單抗、Goat anti-Mouse IgG (H+L) HRP和Goat anti-Human IgG (H+L) HRP購自Abcam公司。蛋白酶抑制劑購自Amresco公司，層析柱、Ni-NTA瓊脂糖凝膠等購自上海源葉生物技術(shù)有限公司。弓形蟲IgG抗體檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法，內(nèi)含標準人源弓形蟲混合抗血清)購自珠海海泰生物制藥有限公司。其他化學試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1弓形蟲速殖子體外培養(yǎng): 用含8%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero細胞，傳代6 h后接種弓形蟲速殖子(速殖子：宿主細胞=1：1)，4 d后收集純化弓形蟲，約1×109個蟲體采用Trizol方法提取總RNA。

1.2.2引物設計與合成: 根據(jù)Uniprot數(shù)據(jù)庫公布的弓形蟲ROP2基因序列(Q27007，B9QMZ1等)全長，設計一對特異性引物，用以克隆ROP2基因全長。

上游引物P1: 5′-GACGACGACAAGATGG-AAAACTGTGCGTCGGTCAGA-3′，下游引物P2: 5′-GAGGAGAAGCCCGGTCATGCCGGTTCTCCAT-CAGTTTG-3′。其中下劃線部分為載體重組序列，其余部分為ROP2基因特異性序列。引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

1.2.3生物信息學分析: 序列處理、蛋白二級結(jié)構(gòu)預測、親水性預測、抗原表位預測等分析分別采用DNAStar軟件包中的Editseq和Protean軟件。蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預測采用TMpred在線分析軟件。信號肽預測采用SignalP-4.1在線分析軟件。

1.2.4逆轉(zhuǎn)錄與基因克隆: 使用Trizol試劑提取弓形蟲總RNA，以TaKaRa pd(N)9隨機引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以特異性引物進行PCR擴增。PCR反應條件為：94 ℃ 預變性3 min；94 ℃ 變性30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸2 min，進行30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物。于1 %瓊脂糖凝膠中電泳。采用QIAquick Gel DNA Extraction Kit純化回收PCR產(chǎn)物。

1.2.5表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定: 將純化后的PCR產(chǎn)物與pET-41 Ek/LIC載體于22 ℃重組連接, 按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌NovaBlue測序菌株，置于不含抗生素的SOC培養(yǎng)基中37 ℃振蕩1 h，將菌體平鋪含卡那霉素(30 μg/mL)的LB平板，挑取10個單菌落，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒后將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌RosettaTM(DE3) pLysS重組表達菌株中。挑取單個菌落，以RT-PCR擴增引物進行菌落PCR鑒定，保存陽性克隆，并將質(zhì)粒送上海生工公司，采用載體通用測序引物進行測序鑒定。

1.2.6重組蛋白誘導表達與鑒定: 在37 ℃，300 r/min搖培養(yǎng)菌至OD600=0.6時，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，誘導表達6 h后離心收集菌體，裂解后進行SDS-PAGE 電泳。陽性克隆擴大至500 mL，誘導表達6 h后裂解并超聲粉碎，Ni-NTA凝膠柱進行純化。純化后的蛋白進行SDS-PAGE電泳，查看純化效果，并采用BCA法進行蛋白定量。進一步采用6×His標簽單抗進行Western blotting鑒定。一抗6×His標簽單抗稀釋度為1：2500，二抗HRP標記的山羊抗小鼠IgG稀釋度為1∶2000，ECL化學發(fā)光法曝光。

1.2.7鑒定重組蛋白免疫反應性: 珠海海泰生物制藥有限公司生產(chǎn)的弓形蟲IgG抗體檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法)備有一份標準人源弓形蟲混合抗血清陽性對照，為多份確診弓形蟲病患者血清的混合稀釋樣品。本研究以該抗血清為一抗，1∶20倍稀釋孵育，二抗HRP標記的山羊抗人IgG稀釋度為1∶2000，采用Western blotting免疫印跡評價rROP2免疫反應性。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果與質(zhì)粒構(gòu)建

本研究擴增DNA片段長度為1 713 bp(含上下游核酸重組序列30 bp)，其中ROP2基因全長1 683 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，分子量大小與預期值相符(圖1)。DNA片段與pET-41 Ek/LIC載體重組連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌NovaBlue測序菌株涂板。陽性克隆的菌落PCR 顯示，擴增DNA 片段與預期片段大小一致, 說明重組質(zhì)粒含有目的基因(圖略)。

圖2 ROP2蛋白二級結(jié)構(gòu)、親水性、抗原表位和蛋白表面結(jié)構(gòu)域預測Fig. 2 Prediction of secondary structure, hydrophilicity, antigenic index, and surface plot of the ROP2 protein

圖1 采用RT-PCR克隆ROP2基因的結(jié)果Fig. 1 RT-PCR amplification of ROP2 geneM：DNA分子量DL2000；1：ROP2 基因RT-PCR產(chǎn)物；2：空白對照。M: DNA marker DL2000; 1: RT-PCR product of ROP2 gene; 2: Blank control.

2.2 測序驗證與序列分析

將2個陽性質(zhì)粒送上海生工公司以載體通用測序引物進行測序，測序結(jié)果顯示，克隆的靶基因序列長度為1 713 bp，含有完整的ROP2開放閱讀框(1 683 bp，編碼561個氨基酸，序列與NCBI-GenBank公布序列相符。DNAStar軟件包中Protean蛋白序列分析表明，ROP2蛋白二級結(jié)構(gòu)以alpha螺旋為主，親水性結(jié)構(gòu)域多于疏水性結(jié)構(gòu)域，蛋白表面結(jié)構(gòu)域多于內(nèi)部結(jié)構(gòu)域，且抗原表位占蛋白序列的比例較高，應該具有較好的免疫反應性(圖2)。另外，TMpred跨膜蛋白結(jié)構(gòu)域預測表明，ROP2蛋白在前段和后段分別含有2個跨膜結(jié)構(gòu)域(12-29，445-465)(圖略)。SignalP 4.1信號肽預測表明，ROP2蛋白前段26個氨基酸為信號肽序列(圖略)。

2.3 重組蛋白電泳誘導表達

目的重組蛋白經(jīng)IPTG誘導表達后采用SDS-PAGE電泳進行初步驗證，考馬斯亮藍-G250染色結(jié)果如圖3所示。誘導表達的目的蛋白與與預期分子量(約98 kDa)相符。其中，ROP2蛋白相對分子質(zhì)量為64 kDa，前端融合1個GST標簽和1個6×HIS標簽約34 kDa。

圖3 ROP2重組融合蛋白SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果Fig. 3 SDS-PAGE analysis of ROP2 recombinant fusion proteinM：低分子量蛋白標準分子量；1：IPTG未誘導的重組大腸桿菌； 2：IPTG誘導6 h后ROP2融合蛋白表達。M: Protein low molecular weight marker; 1: Protein profile not induced by IPTG; 2. ROP2 fusion protein expressed after 6 h induction by IPTG.

圖4 ROP2重組融合蛋白Ni-NTA瓊脂糖凝膠純化效果Fig 4 Purification of recombinant ROP2 fusion protein using Ni-NTAM：低分子量蛋白標準分子量；1: 純化后的ROP2重組融合蛋白；2: 未純化的ROP2重組蛋白對照。M: Protein low molecular weight marker; 1: Purified rROP2 fusion protein; 2: Unpurified rROP2 protein control.

圖5 ROP2重組融合蛋白的Western blotting鑒定Fig. 5 Verification of the recombinant ROP2 fusion protein using Western blotting.M：蛋白標準分子量；1: ROP2重組融合蛋白。M: Protein weight marker; 1: ROP2 recombinant fusion protein.

2.4 目的蛋白純化與Western blotting鑒定

采用Ni-NTA瓊脂糖凝膠柱純化目的重組蛋白，并以SDS-PAGE電泳初步檢測。結(jié)果顯示98 kDa目的蛋白回收效率較高，純化效果較好(圖4)。Ni-NTA瓊脂糖凝膠柱純化后的ROP2重組融合蛋白經(jīng)電泳轉(zhuǎn)膜后，用小鼠6×His單抗進行Western blotting 鑒定。結(jié)果顯示98kDa特異性蛋白條帶，證明該目的蛋白為6×His 融合蛋白(圖5)。

2.5 重組蛋白免疫反應性初步鑒定

圖6 ROP2重組融合蛋白與人源免疫抗血清的免疫反應Fig. 6 Immunological reaction between rROP2 and human anti-T. gondii serumM：蛋白標準分子量; 1: ROP2重組融合蛋白。M: Protein weight marker; 1: ROP2 recombinant fusion protein.

以rROP2重組蛋白為抗原，以標準人源弓形蟲感染混合血清為一抗，Western-blotting免疫印跡實驗結(jié)果表明，盡管來源于弓形蟲病現(xiàn)癥患者的人源抗血清背景復雜，但98 kDa的rROP2重組蛋白與抗血清有顯著免疫印跡反應。(圖6)。

3 討論

弓形蟲棒狀體蛋白2(ROP2)的編碼基因全長約1.7 kb，第98～465位氨基酸序列中富含脯氨酸。ROP2蛋白存在翻譯后加工，由66 kDa蛋白切除信號肽和70多個氨基酸序列后僅剩余55 kDa。ROP2蛋白是弓形蟲毒力因子，參與調(diào)節(jié)納蟲泡膜功能調(diào)節(jié)，且能與宿主乳鐵蛋白互作，可能有助于弓形蟲獲取生長必需的鐵元素。另外，ROP2與宿主線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均有顯著相互作用，可能廣泛參與弓形蟲的物質(zhì)和能量獲取和代謝過程。

本研究通過RT-PCR克隆ROP2基因全長，并原核表達了GST-6×His-ROP2重組融合蛋白。本研究采用的pET41-EK/LIC表達載體與傳統(tǒng)的限制性酶切和連接反應操作策略不同，該載體為線性載體，插入位點為LIC結(jié)構(gòu)，無需限制性內(nèi)切酶和連接酶就可以通過基因重組進行載體構(gòu)建，不僅方便易操作，而且能夠高效、定向地克隆，陽性重組率>95%。該表達載體帶有GST和6×His兩個純化標簽序列，便于表達后的純化，還具有在純化后以蛋白酶將載體的N端標簽序列完全切除的優(yōu)點。

該重組蛋白N端雙標簽封閉了ROP2酶活性，易獲得高表達量重組蛋白。通過選擇工程菌株，優(yōu)化誘導條件，原核系統(tǒng)也可以重組表達98 kDa大分子量蛋白。重組蛋白與人源弓形蟲感染血清有顯著免疫印跡反應。但人源弓形蟲感染血清成分較為復雜，免疫印跡反應中非特異性雜帶較多。由于蛋白免疫反應性主要決定于蛋白一級序列，rROP2的免疫反應性可以反映弓形蟲ROP2蛋白的免疫反應性。另外，本研究通過重組表達帶有GST標簽的ROP2全長融合蛋白，為進一步采用GST Pull-down等技術(shù)研究ROP2蛋白與宿主之間的相互作用，揭示弓形蟲的感染機理奠定了基礎。