楊新周,郝志云,董 毅,朱以常
(德宏師范高等??茖W(xué)校理工系,云南德宏678400)
自由基誘發(fā)氧化損傷對身體健康影響極大,它與很多疾病息息相關(guān),是引起衰老的主要原因[1-3]。自由基能引發(fā)白內(nèi)障、冠心病、癌癥等疾?。?]。近年來,對自由基清除作用及機理的研究成為熱點,從植物中尋找具有抗氧化作用的天然活性成分越來越受到人們的關(guān)注。田基黃及馬蹄菜是兩種常見的中草藥,生于山間、田野較濕潤的地方,田基黃為藤黃科植物,原名地耳草(Hypericum Japonicum Thumb),別名雀舌草,主要用于治療瀉痢、傳染性肝炎、小兒驚風(fēng)、清熱解毒、疳積,蛇蛟傷,腸癰等。馬蹄菜又叫“積雪草”(Centella asiatica(L.)Urb),傣族稱其為“帕朗”,傣族喜歡涼拌食用,具有消腫解毒、清熱利濕的功效[6]。目前,對這兩種中草藥研究較多的是化學(xué)成分的分離及鑒定、揮發(fā)油的測定等[5,7],對這 2 種中草藥清除DPPH自由基及羥自由基的研究鮮見報道。筆者通過對這兩種中草藥乙醇提取物清除自由基能力的測定,希望能為該中草藥的綜合利用提供理論依據(jù)。
V-1100型可見分光光度計(上海美譜達(dá)儀器有限公司),數(shù)字顯示恒溫水浴鍋(HH-S24S,上海君竺儀器制造有限公司),超聲波(SK2200H),電子天平(AR224CN),電熱真空干燥箱(ZK 82J型),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA N一1100)。
DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼),質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99.0%(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);田基黃、馬蹄菜(采于云南德宏州,烘干,粉碎,過篩);槲皮素、山奈酚、咖啡酸、蘆丁、沒食子酸、對香豆酸(購自國藥集團(tuán)浙江華東醫(yī)藥有限公司,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%);番紅花紅、EDTA-Fe2+(現(xiàn)配現(xiàn)用)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、雙氧水(現(xiàn)配現(xiàn)用)、乙醇等試劑均為分析純,實驗用水為二次蒸餾水。
1.2.1 DPPH儲備液的制備
準(zhǔn)確稱取10 mg DPPH,用無水乙醇溶解定容至100 mL容量瓶中,得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的儲備溶液。然后稀釋成0.024 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
1.2.2 提取物的制備
準(zhǔn)確稱取2.0000 g樣品于100 mL的錐形瓶中,加入20 mL的乙醇溶液,封口,超聲提取3次,每次45 min,合并3次濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮,轉(zhuǎn)移到25 mL的容量瓶中,乙醇定容,備用。
1.2.3 清除DPPH自由基能力的測定
準(zhǔn)確移取4.5 mL DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液液,依次加入一定體積的提取物稀釋液于10 mL比色管中,定容至5 mL,置于暗處30 min,在波長517 nm下測定空白DPPH的吸光度值A(chǔ)空白和加入提取物后DPPH的吸光度值 A樣品,按下式計算自由基清除率[8]。
1.2.4 清除羥自由基(·OH)能力的測定
①調(diào)零管:準(zhǔn)確移取1.00 mL PBS于10 mL比色管中,加入3.5 mL的水,37℃水浴中恒溫30 min,室溫下冷卻,調(diào)零。
②對照組:依次加入1.00 mL PBS、1.50 mL 40 μg/mL 番紅花紅、1.00 mL EDTA-Fe(Ⅱ)、1.00 mL蒸餾水于10 mL比色管中,37℃水浴中恒溫30 min,室溫下冷卻,測定吸光度A(λ=520 nm),V總=4.50 mL。
③空白組:依次加入1.00 mL PBS、1.50 mL 40 μg/mL 番紅花紅、1.00 mL EDTA-Fe(Ⅱ)、1.00 mL 3%H2O2于10 mL比色管中,37℃水浴中恒溫30 min,室溫下冷卻,測定吸光度A0(λ =520 nm),V總=4.50 mL。
④樣品組:依次加入1.00 mL PBS、1.50 mL 40 μg/mL 番紅花紅、1.00 mL EDTA-Fe(Ⅱ)、10.0 μL不同濃度的樣品溶液、1.00 mL 3%H2O2于10 mL比色管中,37℃水浴中恒溫30 min,室溫下冷卻,測定吸光度As(λ =520 nm),V總=4.50 mL[9]。羥自由基清除率按下式計算。
按照1.2.3的方法測定田基黃和馬蹄菜提取物清除DPPH自由基活性的能力,以清除率對總固形物濃度作圖,實驗結(jié)果見圖1和圖2。從圖1和圖2中看出,當(dāng)田基黃和馬蹄菜總固形物濃度較低時,DPPH清除率與濃度呈線性關(guān)系,田基黃提取物與DPPH清除率線性方程為:y=543.02x+25.787,R2=0.9911。由方程計算出總固形物IC50=0.04459 mg/mL。馬蹄菜提取物與DPPH清除率線性方程為:y=33.157x+25.932,R2=0.9981。由方程計算出總固形物IC50=0.7259 mg/mL。測定沒食子酸、咖啡酸、香草酸、蘆丁、對香豆酸5種抗氧化劑對DPPH自由基的清除率,并計算出IC50。得出各抗氧化劑濃度與清除率之間線性方程分別如下,咖啡酸:y=15246x-1.0143,R2=0.9933,IC50=0.0033 mg/mL;沒食子酸:y=49340x+4.5849,R2=0.9775,IC50=0.00092 mg/mL;蘆丁:y=8238x+14.592,R2=0.9457,IC50=0.0043 mg/mL;香草酸:y=74.736x+9.116,R2=0.9282,IC50=0.5471 mg/mL;對香豆酸:y=17.437x+10.388,R2=0.9565,IC50=2.27 mg/mL。根據(jù) IC50值越小,表示抗氧化活性越好推論可知,田基黃提取物、馬蹄菜提取物、沒食子酸、咖啡酸、香草酸、蘆丁、對香豆酸清除DPPH·能力順序為沒食子酸>咖啡酸>蘆?。咎锘S提取物>香草酸>馬蹄菜提取物>對香豆酸。
圖1 田基黃提取物對DPPH自由基的清除能力Figure 1 DPPH radical scavenging activity of Hypericum Japonicum Thumb extract
圖2 馬蹄菜提取物對DPPH自由基的清除能力Figure 2 DPPH radical scavenging activity of Centella Asiatica extract
按照1.2.4的方法測定田基黃、馬蹄菜提取物清除羥自由基活性的能力,以清除率對田基黃、馬蹄菜總固形物濃度作圖,實驗結(jié)果見圖3。由圖3可知,清除率隨著樣品濃度的增加而增大,根據(jù)所測定清除率及田基黃、馬蹄菜提取物總固形物濃度的關(guān)系,得出田基黃、馬蹄菜提取物濃度與清除率線性方程分別為:y=6842.1x+21.307,R2=0.9173,IC50=0.0042 mg/mL;y=4052.1x+29.463,R2=0.9394,IC50=0.0051 mg/mL 采用同樣的方法,測定蘆丁、槲皮素、山奈酚、咖啡酸對羥自由基活性的清除率,計算出IC50。各抗氧化劑濃度與清除率之間線性方程分別如下,蘆丁:y=1996.5x+3.0273,R2=0.995,IC50=0.023 mg/mL;槲皮素:y=6694.5x+31.077,R2=0.9947,IC50=0.003 mg/mL;咖啡酸:y=1252.3x+27.674,R2=0.9906,IC50=0.018 mg/mL;山奈酚:y=7735.3x+7.982,R2=0.9998,IC50=0.0054 mg/mL。從實驗結(jié)果可知,田基黃提取物、馬蹄菜提取物、槲皮素、蘆丁、咖啡酸、山奈酚清除羥自由基活性能力順序為:槲皮素>田基黃提取物>馬蹄菜提取物>山奈酚>咖啡酸>蘆丁。
圖3 2種中草藥提取物對羥自由基的清除能力Figure 3 Hydroxyl radical scavenging activity of two kinds of herbal extracts
田基黃、馬蹄菜的提取物都有一定的抗氧化性,尤其是田基黃提取物對DPPH自由基和羥自由基都有較強的清除作用。田基黃、馬蹄菜的提取物清除羥自由基的能力都優(yōu)于山奈酚、咖啡酸和蘆丁,這為尋找天然抗氧化劑提供了一個新的來源。
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