楊新周，郝志云，董 毅，朱以常

(德宏師范高等?？茖W(xué)校理工系，云南德宏678400)

自由基誘發(fā)氧化損傷對身體健康影響極大，它與很多疾病息息相關(guān)，是引起衰老的主要原因［1－3］。自由基能引發(fā)白內(nèi)障、冠心病、癌癥等疾?。?］。近年來，對自由基清除作用及機理的研究成為熱點，從植物中尋找具有抗氧化作用的天然活性成分越來越受到人們的關(guān)注。田基黃及馬蹄菜是兩種常見的中草藥，生于山間、田野較濕潤的地方，田基黃為藤黃科植物，原名地耳草(Hypericum Japonicum Thumb)，別名雀舌草，主要用于治療瀉痢、傳染性肝炎、小兒驚風(fēng)、清熱解毒、疳積，蛇蛟傷，腸癰等。馬蹄菜又叫“積雪草”(Centella asiatica(L.)Urb)，傣族稱其為“帕朗”，傣族喜歡涼拌食用，具有消腫解毒、清熱利濕的功效［6］。目前，對這兩種中草藥研究較多的是化學(xué)成分的分離及鑒定、揮發(fā)油的測定等［5，7］，對這 2 種中草藥清除DPPH自由基及羥自由基的研究鮮見報道。筆者通過對這兩種中草藥乙醇提取物清除自由基能力的測定，希望能為該中草藥的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器和試劑

V-1100型可見分光光度計(上海美譜達(dá)儀器有限公司)，數(shù)字顯示恒溫水浴鍋(HH-S24S，上海君竺儀器制造有限公司)，超聲波(SK2200H)，電子天平(AR224CN)，電熱真空干燥箱(ZK 82J型)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA N一1100)。

DPPH(1，1－二苯基－2－三硝基苯肼)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99.0%(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);田基黃、馬蹄菜(采于云南德宏州，烘干，粉碎，過篩);槲皮素、山奈酚、咖啡酸、蘆丁、沒食子酸、對香豆酸(購自國藥集團(tuán)浙江華東醫(yī)藥有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%);番紅花紅、EDTA-Fe2+(現(xiàn)配現(xiàn)用)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、雙氧水(現(xiàn)配現(xiàn)用)、乙醇等試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗過程

1.2.1 DPPH儲備液的制備

準(zhǔn)確稱取10 mg DPPH，用無水乙醇溶解定容至100 mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的儲備溶液。然后稀釋成0.024 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 提取物的制備

準(zhǔn)確稱取2.0000 g樣品于100 mL的錐形瓶中，加入20 mL的乙醇溶液，封口，超聲提取3次，每次45 min，合并3次濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，轉(zhuǎn)移到25 mL的容量瓶中，乙醇定容，備用。

1.2.3 清除DPPH自由基能力的測定

準(zhǔn)確移取4.5 mL DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液液，依次加入一定體積的提取物稀釋液于10 mL比色管中，定容至5 mL，置于暗處30 min，在波長517 nm下測定空白DPPH的吸光度值A(chǔ)空白和加入提取物后DPPH的吸光度值 A樣品，按下式計算自由基清除率［8］。

1.2.4 清除羥自由基(·OH)能力的測定

①調(diào)零管:準(zhǔn)確移取1.00 mL PBS于10 mL比色管中，加入3.5 mL的水，37℃水浴中恒溫30 min，室溫下冷卻，調(diào)零。

②對照組:依次加入1.00 mL PBS、1.50 mL 40 μg/mL 番紅花紅、1.00 mL EDTA－Fe(Ⅱ)、1.00 mL蒸餾水于10 mL比色管中，37℃水浴中恒溫30 min，室溫下冷卻，測定吸光度A(λ=520 nm)，V總=4.50 mL。

③空白組:依次加入1.00 mL PBS、1.50 mL 40 μg/mL 番紅花紅、1.00 mL EDTA－Fe(Ⅱ)、1.00 mL 3%H2O2于10 mL比色管中，37℃水浴中恒溫30 min，室溫下冷卻，測定吸光度A0(λ =520 nm)，V總=4.50 mL。

④樣品組:依次加入1.00 mL PBS、1.50 mL 40 μg/mL 番紅花紅、1.00 mL EDTA－Fe(Ⅱ)、10.0 μL不同濃度的樣品溶液、1.00 mL 3%H2O2于10 mL比色管中，37℃水浴中恒溫30 min，室溫下冷卻，測定吸光度As(λ =520 nm)，V總=4.50 mL［9］。羥自由基清除率按下式計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 對DPPH自由基清除能力

按照1.2.3的方法測定田基黃和馬蹄菜提取物清除DPPH自由基活性的能力，以清除率對總固形物濃度作圖，實驗結(jié)果見圖1和圖2。從圖1和圖2中看出，當(dāng)田基黃和馬蹄菜總固形物濃度較低時，DPPH清除率與濃度呈線性關(guān)系，田基黃提取物與DPPH清除率線性方程為:y=543.02x+25.787，R2=0.9911。由方程計算出總固形物IC50=0.04459 mg/mL。馬蹄菜提取物與DPPH清除率線性方程為:y=33.157x+25.932，R2=0.9981。由方程計算出總固形物IC50=0.7259 mg/mL。測定沒食子酸、咖啡酸、香草酸、蘆丁、對香豆酸5種抗氧化劑對DPPH自由基的清除率，并計算出IC50。得出各抗氧化劑濃度與清除率之間線性方程分別如下，咖啡酸:y=15246x－1.0143，R2=0.9933，IC50=0.0033 mg/mL;沒食子酸:y=49340x+4.5849，R2=0.9775，IC50=0.00092 mg/mL;蘆丁:y=8238x+14.592，R2=0.9457，IC50=0.0043 mg/mL;香草酸:y=74.736x+9.116，R2=0.9282，IC50=0.5471 mg/mL;對香豆酸:y=17.437x+10.388，R2=0.9565，IC50=2.27 mg/mL。根據(jù) IC50值越小，表示抗氧化活性越好推論可知，田基黃提取物、馬蹄菜提取物、沒食子酸、咖啡酸、香草酸、蘆丁、對香豆酸清除DPPH·能力順序為沒食子酸＞咖啡酸＞蘆?。咎锘S提取物＞香草酸＞馬蹄菜提取物＞對香豆酸。

圖1 田基黃提取物對DPPH自由基的清除能力Figure 1 DPPH radical scavenging activity of Hypericum Japonicum Thumb extract

圖2 馬蹄菜提取物對DPPH自由基的清除能力Figure 2 DPPH radical scavenging activity of Centella Asiatica extract

2.2 對羥自由基(·OH)清除能力

按照1.2.4的方法測定田基黃、馬蹄菜提取物清除羥自由基活性的能力，以清除率對田基黃、馬蹄菜總固形物濃度作圖，實驗結(jié)果見圖3。由圖3可知，清除率隨著樣品濃度的增加而增大，根據(jù)所測定清除率及田基黃、馬蹄菜提取物總固形物濃度的關(guān)系，得出田基黃、馬蹄菜提取物濃度與清除率線性方程分別為:y=6842.1x+21.307，R2=0.9173，IC50=0.0042 mg/mL;y=4052.1x+29.463，R2=0.9394，IC50=0.0051 mg/mL 采用同樣的方法，測定蘆丁、槲皮素、山奈酚、咖啡酸對羥自由基活性的清除率，計算出IC50。各抗氧化劑濃度與清除率之間線性方程分別如下，蘆丁:y=1996.5x+3.0273，R2=0.995，IC50=0.023 mg/mL;槲皮素:y=6694.5x+31.077，R2=0.9947，IC50=0.003 mg/mL;咖啡酸:y=1252.3x+27.674，R2=0.9906，IC50=0.018 mg/mL;山奈酚:y=7735.3x+7.982，R2=0.9998，IC50=0.0054 mg/mL。從實驗結(jié)果可知，田基黃提取物、馬蹄菜提取物、槲皮素、蘆丁、咖啡酸、山奈酚清除羥自由基活性能力順序為:槲皮素＞田基黃提取物＞馬蹄菜提取物＞山奈酚＞咖啡酸＞蘆丁。

圖3 2種中草藥提取物對羥自由基的清除能力Figure 3 Hydroxyl radical scavenging activity of two kinds of herbal extracts

3 結(jié)論

田基黃、馬蹄菜的提取物都有一定的抗氧化性，尤其是田基黃提取物對DPPH自由基和羥自由基都有較強的清除作用。田基黃、馬蹄菜的提取物清除羥自由基的能力都優(yōu)于山奈酚、咖啡酸和蘆丁，這為尋找天然抗氧化劑提供了一個新的來源。

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