韓春艷，鄭清梅，陳桂丹，劉麗霞

(嘉應(yīng)學院 生命科學學院，廣東 梅州 514015)

近年來研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸作為一種基因表達的調(diào)控物可以直接和獨立地調(diào)節(jié)基因表達.尤其是n－3和n－6系列多不飽和脂肪酸(PUFA)與基因調(diào)節(jié)之間的關(guān)系最為密切［1］.對于魚類來講，脂肪作為能量的主要來源，其代謝的主要場所是肝臟，因此研究魚類肝臟中的脂類代謝就顯得尤為重要.

已有大量的研究表明，飼料中不同來源脂肪直接影響魚類(包括:草魚［2］、鯉魚［3］和羅非魚［4］等)體內(nèi)的脂肪代謝.但目前研究主要以活體動物為主，未見細胞水平的相關(guān)研究.隨著細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，體外培養(yǎng)的原代魚肝細胞在不同領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用［5］.研究表明，來自活體經(jīng)原代培養(yǎng)的肝細胞在合適培養(yǎng)條件下可以保持1周到數(shù)周的活力［6］，而且保持了大部分初始活體特征［7］.因此，利用原代培養(yǎng)肝細胞進行相關(guān)研究不失為一種快速、經(jīng)濟的研究手段.由于魚類的種類繁多，與哺乳動物比較魚類肝臟較小且血管系統(tǒng)不發(fā)達，因此采用灌注法對儀器要求高、操作難度大，一般實驗室內(nèi)很難完成.與之比較目前常用酶消化法進行肝臟細胞分離和制備，操作較為容易，但因肝臟內(nèi)血細胞豐富如分離純度不高會影響進一步的研究.本研究擬以奧尼羅非魚為研究對象初步探索肝臟細胞分離方法，并進一步研究培養(yǎng)基中添加不同類型的脂肪酸對其中與脂類代謝有關(guān)的酶(包括:脂蛋白脂酶(LPL)和蘋果酸脫氫酶(MDH))及相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子(PPARα(過氧化物酶體增殖物激活受體 －α))基因表達的影響，旨在為不同類型脂肪酸對魚類脂類代謝影響機制及進一步的營養(yǎng)調(diào)控提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

150g左右的奧尼羅非魚由華南師范大學生物園提供.基礎(chǔ)培養(yǎng)基是 DMEM(Gibco)，添加10%FBS.主要試劑:Ⅱ型膠原酶(CollagenaseⅡ)、DEPC(Sigma公司)、胎牛血清(NCS)、PrimeScript RT Kit(Perfect Real Time)200次量反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Premix Taq(Takara)、RNA提取試劑盒 TRIZOL(Invitro-gen)、DL2000(天根生化公司)，其余化學試劑均為分析純.

脂肪酸標準液(Sigma):使用無水乙醇配制成1M的儲備液于－80℃凍存，使用時用培養(yǎng)基配制成最終濃度.

1.2 儀器設(shè)備

無菌手術(shù)器械，IX70－S8F2倒置顯微鏡(日本Olympus，IX70)，22R臺式冷凍離心機(德國Eppendrof)，超凈工作臺，CO2培養(yǎng)箱.

1.3 羅非魚肝臟細胞的分離及純化

無菌條件下，取羅非魚肝臟、剪成小塊，PBS液反復洗滌至液體澄清.靜置后吸除洗液.加入Ⅱ型膠原酶溶液置于冰上消化30 min.120目尼龍網(wǎng)過濾，以除去結(jié)締組織和細胞團塊.將細胞濾液于4℃離心機中離心.分別采用90 g，60 g和30 g反復進行離心，每次用PBS液洗滌.最后除去上清液，加入含胰島素、1%青霉素和鏈霉素細胞培養(yǎng)液制成肝細胞懸液.血細胞計數(shù)板計算細胞數(shù)，根據(jù)鏡下細胞形態(tài)判斷肝細胞和雜質(zhì)細胞，肝細胞數(shù)所占細胞總數(shù)的百分率，即純度.臺盼藍拒染法測活力.

1.4 肝臟細胞的原代培養(yǎng)

用細胞培養(yǎng)液將肝細胞懸液稀釋至細胞密度為5×105個/ml，取3 ml稀釋液接種于細胞培養(yǎng)板中(Coring，6孔)，隨機分為6組，每組3孔，于27℃的CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).24h后小心移除培養(yǎng)基以添加16:0脂肪酸的培養(yǎng)基為對照組，以培養(yǎng)基中分別添加不同飽和度的脂肪酸(18:1 n－9，18:2n－6，20:4 n－6，20:5 n－3和22:6 n－3)為實驗組，繼續(xù)培養(yǎng)48h后提取細胞RNA，每個處理3個重復，整體實驗重復2次.

1.5 定量方法

細胞RNA的提取參照Invitrogen試劑說明書;采用分光光度計測定提取RNA濃度及OD260/280，樣品 RNA濃度均保持在 150～200 ng/μL，OD260/280測定值在1.8～2.0.反轉(zhuǎn)錄時采用800 ng RNA/20μL體系，參照Takara試劑盒說明書.

采用相對定量方法，以β－actin為參照基因，對目的基因mRNA表達豐度進行測定，引物見表1.

表1 本研究所使用的引物序列及相關(guān)參數(shù)

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用 SPSS 16.0 軟件(SPSS Inc.，USA)對所得相關(guān)數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One－Way ANOVA)，并進行 Duncan＇s多重比較，P ＜0.05 具有顯著性差異.所有結(jié)果以平均值±標準差(mean±SD.)表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 肝細胞的產(chǎn)量、純度及活力

本實驗以膠原酶冷消化法消化分離羅非魚肝細胞，膠原酶的濃度為0.25%，用量為所消化肝組織的3～5倍，消化時間為0.5h.新分離的肝細胞透亮，近似圓形，有立體感，呈單個分散狀態(tài)，細胞核清晰，偶有小細胞團，其中含有少量血細胞.依表2可見，反復低速離心可有效去除雜細胞，經(jīng)24h的培養(yǎng)，細胞貼壁狀況良好，細胞間出現(xiàn)索狀排列、島狀連接，為進一步研究提供保證.

表2 不同離心條件下羅非魚肝細胞的產(chǎn)量和純度

2.2 不同類型的脂肪酸對肝臟細胞內(nèi)與脂類代謝相關(guān)基因表達的影響

由表3可見，隨著脂肪酸不飽和程度的增加LPL和PPARα的基因表達明顯上升.其中培養(yǎng)基中添加了20:5 n－3(EPA)和22:6 n－3(DHA)兩種脂肪酸的肝臟細胞內(nèi)LPL和PPARα的表達量顯著高于添加飽和性脂肪酸組.其余各組間差異不顯著.而MDH表達則呈現(xiàn)相反趨勢.

表3 不同類型的脂肪酸對肝臟細胞內(nèi)與脂類代謝相關(guān)基因表達的影響

3 討論

目前，魚類肝細胞分離的方法主要有兩種，直接消化法和兩步灌注法［5］.兩步灌流法因其得到的細胞純度高、活力好，得到廣泛應(yīng)用.但這一方法只適用于肝組織具有比較發(fā)達門靜脈系統(tǒng)的魚類，如蛙魚類等.對于沒有門靜脈的魚類(如羅非魚)，灌流時通常需從腹部的動脈或是心臟插入針管，這種操作難度大，常常達不到理想效果，且灌注法多適用于個體比較大的成魚，個體較小的魚極難成功.因此，對于個體較小的魚一般均采用直接消化法.但由于肝臟中血管豐富，直接消化法會導致肝臟細胞與血細胞混雜在一起，需進一步的分離.另外如消化時間過長還會影響肝臟細胞的活力.

因此，在本研究嘗試采用低溫消化，多次分級離心的方法得到了較好的細胞純度及產(chǎn)量.

LPL是脂質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)運過程中的關(guān)鍵酶，其參與各種脂蛋白的代謝并對其進行調(diào)控.使血漿中富含脂質(zhì)的脂蛋白降解，以供機體組織儲存和利用，因此與機體的脂質(zhì)代謝及肥胖密切相關(guān)［2～3］.對人等哺乳動物的研究表明，肝臟LPL基因僅在胚胎期表達，出生后不久即被關(guān)閉［8～9］，而魚類肝臟已證實存在具有LPL活性.本實驗室前期研究表明其活性及基因表達受飼料中脂肪水平和脂肪來源的調(diào)控［4］，其他研究者也有類似的發(fā)現(xiàn)［10，11］.相關(guān)研究顯示，不同脂肪酸對魚類脂類代謝的影響很大程度上與不飽和脂肪酸，尤其與高度不飽和脂肪酸的差異有關(guān)［2，10－12］.本研究表明，隨脂肪酸的不飽和程度增加，LPLmRNA的表達顯著提高，特別是添加了DHA和EPA后其表達量增加至最大，這與以上的研究結(jié)果類似.

PPARα是一個樞紐型的轉(zhuǎn)錄因子，在肝臟、骨骼肌及腎臟中高度表達，主要是通過配體結(jié)合后的活化而發(fā)揮其生物學效應(yīng).作為依賴配體的核轉(zhuǎn)錄因子，PPARα與9－順式視黃酸類受體(RXR)形成異二聚體后，PPARα－RXR復合物與靶基因啟動子上的特異DNA反應(yīng)元件(PPRE)結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用.目前已知天然配體有亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸代謝產(chǎn)物白三烯等.Ruby等［14］發(fā)現(xiàn)，極低密度脂蛋白(VLDL)水解所釋放的脂肪酸作為配體可以激活PPARα.PPARα調(diào)控與甘油三酯(TG)、VLDL代謝相關(guān)的載脂蛋白(Apo)CIII和LPL關(guān)鍵基因的表達，進而促進 TG和 VLDL代謝［15］.Rudkowska等［16］報道，在人肝細胞HepG2培養(yǎng)液中添加n－3脂肪酸可以通過PPARα促進LPL的轉(zhuǎn)錄活性.Rakhshandehroo等［17］利用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，活化或阻斷肝組織PPARα能夠調(diào)控一系列與脂類代謝相關(guān)基因的表達，包括激素敏感脂肪激酶(HSL)、脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)等.梁旭芳等已發(fā)現(xiàn)真鯛LPL基因5'側(cè)翼區(qū)序列中存在順式元件－－過氧化酶體增殖物反應(yīng)元件，同時發(fā)現(xiàn)飼料中脂肪酸的不飽和度影響LPL的表達，因此推斷脂肪酸通過氧化代謝來促進PPAR表達對真鯛肝臟LPL基因表達水平的作用應(yīng)大于脂肪酸直接作為配基激活LPL基因表達的影響［10］.本研究發(fā)現(xiàn)，LPL和PPARα受脂肪酸不飽和程度的影響具有一致性，但究竟二者之間以何種關(guān)系相互關(guān)聯(lián)，值得進一步探討.

NADPH是動物體內(nèi)脂肪酸合成及其碳鏈延長的重要輔酶，是脂肪酸還原合成中氫的供給者，體內(nèi)NADPH供應(yīng)情況直接影響脂肪及類脂的合成.脂肪代謝酶主要包括能生成 NADPH的酶，如乙酰CoA羧化酶 (ACX)、MDH、異檸檬酸脫氫酶(ICDH)、葡萄糖 －6－磷酸脫氫酶(G－6－PDH)等［18］.周繼術(shù)［3］對鯉肝胰臟該兩類酶的研究發(fā)現(xiàn)，魚油組鯉肝胰臟MDH、G－6－PDH活力均低于富含亞油酸的對照組，且MDH的活性顯著降低，顯示出富含EPA、DHA的魚油抑制了鯉肝胰臟脂質(zhì)合成，這與EPA、DHA比亞油酸更能有效抑制大鼠肝臟中脂肪酸合成酶活性一致［19］.本研究發(fā)現(xiàn)，DHA可明顯降低MDH mRNA的表達，MDH與PPARα之間并無顯著關(guān)聯(lián).

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