文 峰，陳 蘭，程建國，霞 明

(1.解放軍第161醫(yī)院 消化內(nèi)科，湖北武漢，430010;2.湖北省武漢市第六醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北武漢，430015)

胃癌是中國最常見的惡性腫瘤之一，其浸潤、轉(zhuǎn)移是患者的主要致死原因。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程涉及多個基因的改變。Ezrin是ERM(Ezrin，radixin，moesin)家族的成員，作為骨架連接蛋白能與黏附分子連接，參與調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并有維持細胞形態(tài)和運動等多種功能。近年來Ezrin在腫瘤浸潤生長與侵襲轉(zhuǎn)移中的作用受到關(guān)注［1－2］。CD44作為一個跨膜糖蛋白，參與細胞的黏附及遷移，在腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲中表達增加。本文采用免疫組化法檢測人體胃癌標本中Ezrin、CD44的陽性表達，旨在探討Ezrin、CD44對癌細胞分化和黏附的影響及其對胃癌浸潤、轉(zhuǎn)移的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

采集2008—2010年解放軍161醫(yī)院病理診斷為胃癌的手術(shù)標本64例，有50例附癌旁組織。其中男40例，女24例，年齡42～74歲。依據(jù)WHO胃腫瘤分類標準(2002年)將其分類:管狀腺癌46例，乳頭狀腺癌11例，腺鱗癌4例，未分化癌3例。為便于統(tǒng)計，把乳頭狀腺癌和高分化管狀腺癌一同列入高分化腺癌組，把未分化癌列入低分化腺癌組，并將中分化腺癌組和高分化腺癌組列為一組。

1.2 試驗試劑

鼠抗人Ezrin單克隆抗體(NewoMarkers公司)，鼠抗人CD44單克隆抗體及兔抗人actin單克隆抗體(福州邁新試劑公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 標本處理:每例組織用40 g/L甲醛固定后石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片10張，取2張切片分別作Ezrin、CD44免疫組織化學染色，1張行HE染色作光鏡下診斷復(fù)查，剩余備用。

1.3.2 免疫組化:標本切片常規(guī)脫蠟置水，用pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)抗原，先后用過氧化物酶及小牛血清處理抗原，Ⅰ抗室溫下孵育1 h后分別滴加Ⅱ、Ⅲ抗，行DAB顯色。以PBS液替代I抗作陰性對照，陽性對照用已知陽性標本。蘇木素復(fù)染細胞核。Ezrin在胞質(zhì)內(nèi)呈棕色顆粒，CD44v6在細胞膜上呈棕黃色的線狀分布。根據(jù)染色強度和陽性表達細胞數(shù)，參考Mathew分級標準:陰性(－)，無陽性細胞者;陽性(+)，＜50%細胞陽性表達或染色較淺;強陽性(2+)，≥50%細胞陽性表達且深染。

1.3.3 蛋白提取:Western-blotting裂解細胞提取蛋白，測定蛋白濃度并取 50 g的蛋白，10%不連續(xù)，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，60V恒壓電流下轉(zhuǎn)移2 h至PVDF膜，將膜在室溫下?lián)u動封閉1 h，將Ⅰ抗用含5%脫脂奶粉稀釋至適當濃度(1∶1000～1∶5000)，將膜于Ⅰ抗中室溫孵育2 h后回收Ⅰ抗，在室溫下漂洗將辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗稀釋至1∶1000，將膜于Ⅱ抗中室溫下孵育2 h，室溫下漂洗，ECL顯色，暗室曝光顯影蛋白的相對表達量取目的蛋白與actin的灰度比。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 18.0作數(shù)據(jù)統(tǒng)計。各組指標與臨床病理間的關(guān)系用χ2檢驗和Spearman等級相關(guān)分析，P＜0.05有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 Western-blotting檢測

在胃癌組織中，Ezrin與CD44v6呈明顯高表達。見圖1。

圖1 胃癌組織中Ezrin與CD44v6表達的Western-blotting檢測

2.2 免疫組化染色

2.2.1 Ezrin表達特點:Ezrin在64例癌組織中陽性表達率為60.9%。Ezrin主要沿細胞膜內(nèi)側(cè)線性分布，在胞質(zhì)中呈棕色顆粒，在腫瘤組織中從局灶性至彌漫性均有表達(見圖2)，以彌漫性表達為主，在癌周組織中的陽性表達也以彌漫性為主，但表達率顯著低于腫瘤組織(P＜0.01);低分化胃癌Ezrin陽性表達率顯著高于高分化胃癌(P＜0.05);在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中Ezrin陽性率也明顯增高(P＜0.05);在不同性別和浸潤深度的2組間陽性表達無顯著差異，提示Ezrin表達與性別和浸潤深度不相關(guān)(P＞0.05)。

2.2.2 CD44v6表達特點:CD44v6在 64 例胃癌組織中陽性表達率為65.6%。CD44v6陽性表達呈棕黃色，多定位在細胞膜和胞質(zhì)上(見圖 3)，在腫瘤組織表達陽性率明顯高于癌周組織(P＜0.05);在低分化胃癌表達顯著高于高分化胃癌(P＜0.05);在侵及漿膜及漿膜外者陽性表達率較侵及肌層者明顯增高(P＜0.05);在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中陽性表達率顯著增高(P＜0.05)。見表1。

圖2 Ezrin在胃癌組織中的陽性表達

圖3 CD44v6在胃癌組織中的陽性表達

2.3 Ezrin、CD44表達的相關(guān)性

兩者在胃癌組織中的表達密切相關(guān)(χ2=17.580，P=0.000)。Spearman 等級相關(guān)分析提示Ezrin表達與CD44表達呈正相關(guān)(r=0.303，P＜0.05)。

2.4 Ezrin/CD 44的聯(lián)合表達與胃癌浸潤和轉(zhuǎn)移

在Ezrin(－)/CD44(－)的15例癌標本中，6例浸潤至漿膜層(40%)，4例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(26.7%);而在 Ezrin(+)/CD44(+)的26例癌標本中，15例浸潤至漿膜層(57.7%)，16例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(61.5%)。兩者比較差異均有統(tǒng)計學意義，P 分別為0.043和0.016。

3 討論

Ezrin蛋白和ERM家族其他成員有著高度(75% ～80%)同源性，其基因位于染色體6q25.2-q26，mRNA長3166bp，共編碼585個氨基酸。Ezrin蛋白表達具有相對的細胞及組織特異性，常和Moesin(膜突蛋白)、Radixin(根蛋白)在細胞膜內(nèi)面共同表達，維持細胞形態(tài)和生存，并參與許多疾病的發(fā)病過程。Ezrin蛋白通過與某些腫瘤細胞表面黏附分子的相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤細胞的某些特性，從而對腫瘤細胞的分化、侵襲和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生重要影響［3］。許多腫瘤組織中都可檢測到Ezrin的高表達。Meng等［4］的實驗結(jié)果表明，Ezrin的高表達能夠促進胰腺癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，從而促進胰腺癌轉(zhuǎn)移。Gschwantler-Kaulich D等［5］在研究乳腺癌時發(fā)現(xiàn)，Ezrin在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的表達明顯高于其良性病變中的表達，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者更為明顯，提示Ezrin對乳腺癌的發(fā)生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有重要的影響。本組研究結(jié)果提示，Ezrin在胃癌中的表達顯著增高，而且其陽性表達與胃癌的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，提示Ezrin蛋白很可能參與了胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移的全過程。隨著Ezrin在不同腫瘤中表達水平的深入研究，Ezrin有可能成為提示多種腫瘤預(yù)后或者轉(zhuǎn)移的分子標記物。

CD44是一個多功能的細胞表面黏附分子，在細胞表面分布廣泛，參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要環(huán)節(jié)，與腫瘤細胞的增生、遷移、侵襲密切相關(guān)［6－7］。近來研究表明，Ezrin與CD44這類膜受體蛋白分子有極為復(fù)雜的相互作用［8］。Ezrin的高表達可能參與腫瘤轉(zhuǎn)移全過程的多個環(huán)節(jié)，從原發(fā)灶癌細胞脫落、侵入周圍組織、播散入脈管系統(tǒng)、透過基底膜、在靶器官增殖形成轉(zhuǎn)移灶等，Ezrin有可能作為腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中各個環(huán)節(jié)、各條通路的中心調(diào)控因素而發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，肝細胞生長因子刺激后CD44的過度表達會導(dǎo)致Ezrin集中，而Ezrin改變CD44的胞質(zhì)尾區(qū)并結(jié)合后與細胞骨架蛋白相互作用，是腫瘤轉(zhuǎn)移的前提條件［9］。

免疫組化實驗及Western-blotting檢測結(jié)果證實，Ezrin、CD44的陽性表達在癌組織和癌旁組織中都存在明顯的差異，Ezrin、CD44的陽性表達在胃癌組織中顯著增高，表達程度隨著腫瘤分化程度降低而增高，提示兩者與胃癌發(fā)生、發(fā)展和分化密切相關(guān)。Ezrin、CD44在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的陽性表達顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例，提示Ezrin、CD44可能共同參與了胃癌的淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移過程。而CD44與Ezrin的陽性表達密切相關(guān)，也提示Ezrin可能需要通過與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的黏附分子協(xié)同發(fā)揮作用。因此，臨床對二者進行聯(lián)合檢測可能作為對胃癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的重要預(yù)測指標。

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