王冬艷，華 欣，葉記林，李晶晶，李 芹，嚴慧深

(1.揚州職業(yè)大學醫(yī)學院，2.江蘇省蘇北人民醫(yī)院，江蘇揚州，225009)

常用中藥白首烏，使用歷史悠久，其主要來源有3種:耳葉牛皮消(Cynanchum.auriculatum Royle ex Wight)、泰山白首烏(Cynanchum bungei Decne)、隔山消［Cynanchum.wilfoldii(Maxim)Hemsl)］?，F(xiàn)常用的白首烏藥材的植物為耳葉牛皮消，主產(chǎn)于江蘇，為地產(chǎn)道地藥材，多為栽培。耳葉牛皮消根莖的醇提物在體內(nèi)外有抗腫瘤活性，其對人腫瘤細胞系 K562、SHG44、HCT-8、A549和PC3及對小鼠移植性肉瘤S180都有抑制作用［1］。C21甾體苷是白首烏中公認的主要活性成分［2］，具有抗腫瘤、增強免疫、抗衰老、保肝護肝等藥理作用，其中白首烏苷可阻止肝癌細胞DNA合成［3］，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。白首烏C21甾體酯苷對正常及免疫抑制動物均有明顯的免疫增強作用，可使小鼠胸腺和脾臟不因受免疫抑制劑而萎縮，對免疫器官具有一定的保護作用［4］。本實驗建立了移植性腫瘤模型，觀察C21甾體苷聯(lián)合化療后的腫瘤抑制作用和對骨髓造血的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品和主要試劑

白首烏C21甾體苷由中國藥科大學提供;環(huán)磷酰胺(CTX)，為上海華聯(lián)制藥公司產(chǎn)品;羧甲基纖維素，由Sigma公司提供;AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，為瑞士羅氏公司產(chǎn)品;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 動物與瘤株

清潔級ICR小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由揚州大學實驗動物中心提供，合格證號:SYXK 2002—0045。肝癌實體型Heps:由中科院上海藥物研究所提供，江蘇省腫瘤防治研究所藥物研究室傳代保種。

1.3 主要設(shè)備及儀器

LABCONCO超純水機:上海和杰科技控股有限公司;AIR-TECH超凈工作臺:蘇州凈化集團安泰公司;BP11OS電子天秤:德國SARTORIUS公司;醫(yī)用解剖器械:蘇州醫(yī)療器械廠;全自動血液分析儀SYSMEX xs-800i:希森美康醫(yī)用電子公司生產(chǎn);流式細胞儀:美國BD公司產(chǎn)品。

1.4 模型制備及動物分組和給藥

參照移植性腫瘤研究方法［5］:無菌條件下抽取傳代第8 d荷瘤小鼠的腹水，以無菌生理鹽水稀釋，調(diào)整細胞濃度在1.0×107/mL，每鼠于右前肢皮下接種0.2 mL。接種24 h后小鼠稱重隨機分為正常對照組、模型對照組(1%羧甲基纖維素鈉溶液)、白首烏C21甾體苷20 mg/kg劑量組、化療組(環(huán)磷酰胺)和聯(lián)合組(環(huán)磷酰胺+白首烏C21甾體苷)，每組12只，組間平均體質(zhì)量差異不超過1 g，灌胃給藥0.2 mL/10 g，1次/d。

1.5 體質(zhì)量和抑瘤率的測定

末次給藥24 h后脫頸椎處死小鼠，解剖剝離腫瘤稱重，依據(jù)公式:抑瘤率=(1－實驗組平均瘤質(zhì)量/陰性對照組平均瘤質(zhì)量)×100%。

1.6 外周血常規(guī)檢測

第14天各組小鼠經(jīng)摘除眼球采血后，用血液分析儀分別計數(shù)外周血白細胞數(shù)、紅細胞數(shù)、血小板數(shù)［6］。

1.7 骨髓有核細胞計數(shù)

將各組小鼠脫臼處死，取完整右側(cè)股骨，用磷酸鹽緩沖液反復沖洗骨髓腔，收集全部骨髓形成單核細胞懸液，血球計數(shù)板計數(shù)，計算出每根骨髓含有的有核細胞數(shù)［7］。

1.8 流式細胞術(shù)檢測骨髓細胞凋亡率

取1×106個骨髓細胞，參照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒方法處理后，采用流式細胞儀檢測。以未染色細胞調(diào)零，以Annexin V-FITC單染管和PI單染管作為基準參照，測定每個上樣管數(shù)據(jù)。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)處理用均數(shù)±標準差±s)表示，組間比較用t檢驗，多組間比較用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 對小鼠體質(zhì)量及抑瘤率的作用

各組小鼠均在接種后3～5 d內(nèi)出現(xiàn)可觸及的瘤結(jié)節(jié)，并呈進行性增大。實驗過程中無腫瘤消退，個別動物死亡，立即解剖肉眼觀察未見明顯病理改變。重復3批實驗抑瘤效果穩(wěn)定?；熃M小鼠體質(zhì)量較正常組和模型組均明顯下降，與白首烏組和聯(lián)合治療組比較亦有顯著差異。對肝癌實體型Heps各用藥組均顯示較強的抑制作用，白首烏組為37.74%，化療組抑瘤率為60.24%，聯(lián)合治療組抑瘤率為59.67%，化療組與白首烏組比較差異有有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，與聯(lián)合治療組比較無差異。初步說明白首烏C21甾體苷具有對肝癌實體型Heps的抑制作用，作用不及環(huán)磷酰胺，并且無合用增加抑制作用，但白首烏能改善化療帶來的體質(zhì)量下降。見表1。

2.2 外周血常規(guī)比較

與正常對照組相比，模型組的外周血白細胞數(shù)、紅細胞數(shù)、血小板數(shù)均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01或P＜0.05)，表明荷瘤后降低小鼠外周血常規(guī)顯著降低;與模型對照組相比，化療組的白細胞下降明顯;與化療組相比白首烏組能明顯增加白細胞、紅細胞和血紅蛋白的量，血小板的改變不明顯;聯(lián)合用藥后，白首烏能改善環(huán)磷酰胺的白細胞和血紅蛋白的減少。說明白首烏C21甾體苷能改善化療帶來的血象抑制作用。見表2。

表1 對小鼠體質(zhì)量影響和抑瘤作用比較±s，n=10)

表1 對小鼠體質(zhì)量影響和抑瘤作用比較±s，n=10)

與正常組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，△△P＜0.01;與化療組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

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表2 對小鼠體質(zhì)量影響和抑瘤作用比較±s，n=10)

表2 對小鼠體質(zhì)量影響和抑瘤作用比較±s，n=10)

與正常組比較，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與化療組比較，#P＜0.05，##P ＜0.01。

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2.3 對小鼠骨髓細胞計數(shù)和骨髓細胞凋亡的影響

結(jié)果如表3和圖1所示，與正常組比較，荷瘤小鼠骨髓細胞計數(shù)和凋亡率均有明顯差異(右側(cè)2個象限細胞數(shù)之和代表凋亡細胞數(shù));骨髓細胞計數(shù)白首烏組和聯(lián)合治療組均較環(huán)磷酰胺組明顯上升;骨髓細胞凋亡率環(huán)磷酰胺為(23.20±4.16)%，比模型組(6.50 ±5.93)%明顯上升，而白首烏組和聯(lián)合治療組的骨髓細胞凋亡均較環(huán)磷酰胺組有明顯下降。說明白首烏C21甾體苷能降低環(huán)磷酰胺化療帶來的骨髓抑制作用。

表3 骨髓細胞計數(shù)和對小鼠凋亡率的比較±s，n=10)

表3 骨髓細胞計數(shù)和對小鼠凋亡率的比較±s，n=10)

與正常組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05，△△P ＜0.01;與化療組比較，##P ＜0.01。

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圖1 小鼠骨髓細胞凋亡流式圖

3 討論

惡性腫瘤的治療包括手術(shù)、放療及化療等，但在治療過程中會對機體的正常組織及細胞產(chǎn)生強烈的殺傷作用。目前，化療藥物仍存在毒副反應(yīng)大等問題，化療可致外周血常規(guī)全面降低，又加重了感染、出血等風險，導致機體免疫失衡，甚至危及生命。近年來，天然抗癌藥物成為世界新藥研發(fā)的熱點［8］，中藥抗腫瘤研究日益受到重視［9－10］，中藥及其有效成分抗腫瘤作用的研究得到世界范圍的重視［11－12］。

環(huán)磷酰胺屬于烷化劑類細胞毒藥物，是臨床上常用的廣譜細胞周期非特異性化療藥，對增殖周期中的各期細胞均有較強的殺滅作用，但治療同時易產(chǎn)生一系列毒副作用，多表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性及骨髓抑制，高劑量時亦常見惡心嘔吐。因此，在強調(diào)殺傷腫瘤細胞同時，保護骨髓造血功能已成為影響化療療效的重要因素和后續(xù)化療能否順利進行的重要保障。中醫(yī)藥以療效確切、毒副反應(yīng)少、價格低廉等優(yōu)點成為當前防治骨髓抑制的研究熱點，且中藥配合放射治療、化學治療(化療)具有減毒增效作用［13］。

已有實驗證明，C21甾體苷能抑制肝癌Heps，誘導腫瘤細胞凋亡［14］，增強荷瘤小鼠的免疫功能［15］。本實驗中對肝癌實體型Heps各用藥組均顯示較強的抑制作用，白首烏組的腫瘤抑制作用不及化療組，但體質(zhì)量下降和小鼠生存狀態(tài)上表現(xiàn)了中藥抗腫瘤的優(yōu)勢。血象反映出機體造血系統(tǒng)的功能狀態(tài)，荷瘤后小鼠外周血象降低，白首烏C21甾體苷能改善荷瘤小鼠外周血象，與環(huán)磷酰胺聯(lián)合用藥后，白首烏能改善化療后小鼠的白細胞和血紅蛋白的減少。荷瘤小鼠骨髓細胞計數(shù)減少和凋亡率上升，使用化療藥物后骨髓抑制更嚴重，而白首烏C21甾體苷能改善荷瘤和化療后骨髓抑制狀態(tài)。本實驗結(jié)果表明，白首烏C21甾體苷具有抗肝癌Heps活性，其抑瘤作用雖弱于環(huán)磷酰胺，但可促進骨髓增殖，與化療藥合用可減輕化療的骨髓抑制作用。

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