崔同霞，白江平，魏桂民，趙旭,2，王蒂*，張金文*

(1．甘肅省作物遺傳改良與種質創(chuàng)新重點實驗室 甘肅省干旱生境作物學重點實驗室 甘肅農業(yè)大學農學院, 甘肅 蘭州730070;2．甘肅省農墾農業(yè)研究院，甘肅 武威733006)

糖苷生物堿(steroidal glycoalkaloids, SGAs)是茄科和百合科等許多植物主要的次生代謝產物。它具有強大的溶解特性和抑制乙酰膽堿酯酶活力[1-2]。它可以麻痹呼吸系統(tǒng)和運動系統(tǒng)中樞神經，并有溶血和刺激、腐蝕粘膜的作用，甚至有致畸和致死的可能。在馬鈴薯(Solanumtuberosum)中，當SGA含量超過200 mg/kg FW時，嚴重影響食味并且威脅食品安全性[3]。但是，SGAs能阻止動物或昆蟲的取食及微生物的攻擊[4-5]，這為育種家培育抗病蟲害的品種奠定了良好的基礎。

糖苷生物堿的含量與外界條件有一定的關系。當溫度達到10℃時，長期貯藏的馬鈴薯塊莖中的SGAs含量可以增加到518 mg/kg FW[6]，而且隨著貯藏時間的延長，特別是貯藏期間見光，薯皮變綠，SGAs的含量明顯增加。本課題組在前期的研究中發(fā)現紅光對塊莖SGAs含量有明顯的誘導作用，其次為藍光[7]。在馬鈴薯栽培種中α-茄堿和α-查茄堿是2個天然存在的主要類固醇糖苷生物堿，占總生物堿苷類的95%，這兩種生物堿具有協(xié)同增效作用，被糖苷生物堿合成代謝支路的末端茄啶糖基轉移酶 (solanidine glycosyltransferases) 催化。目前，已鑒定并克隆出的3個糖基轉移酶[8]，分別是茄啶半乳糖基轉移酶 (solanidine galactosyltransferase, SGT1)、茄啶葡萄糖基轉移酶 (solanidine glucosyltransferase, SGT2)和鼠李糖轉移酶 (rhamnosyl transferase, SGT3)，其中SGT1和SGT2分別催化產生γ-茄堿和γ-查茄堿，SGT3催化β-茄堿和β-查茄堿轉化為其相應的α形式[9-10]。為了進一步研究此類基因的表達特點以及調控機制，Rockhold等[11]已經克隆到SGT2啟動子，并將其構建β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase, GUS)融合表達載體導入到馬鈴薯中，發(fā)現葉片中的GUS的表達量明顯高于塊莖中的，但均低于陽性對照CMV 35S (cauliflower mosaic virus) 啟動子驅動的轉基因植物。對于馬鈴薯SGT1和SGT3兩種糖基轉移酶的調控與啟動子功能的研究尚未見報道。

本研究擬通過紅光誘導處理，研究馬鈴薯糖苷生物堿合成代謝關鍵酶SGT3的基因光誘導表達特點；確定并克隆SGT3基因啟動子序列，通過用PLANTCARE和PLACRE軟件對啟動子序列進行分析，構建不同缺失片段啟動子與報告基因GUS的融合基因，進行煙草(Nicotianatabacum)的瞬時表達和穩(wěn)定遺傳轉化，檢測不同缺失片段啟動子驅動的轉基因植株中報告基因的表達水平，以此分析馬鈴薯SGT3基因啟動子的功能。

1 材料與方法

1.1 植物材料

馬鈴薯栽培種庒薯3號的無菌組培苗、微型薯以及四倍體煙草品系T12均由甘肅省作物遺傳改良與種植創(chuàng)新重點實驗室提供。

1.2 菌株和質粒

大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α、農桿菌 (Agrobacteriumtumefaciens) LBA4404、表達載體pBI121(圖1)均由本實驗室保存。SGT3啟動子(NCBI注冊號：KC331037)。中間載體 pGEM?-T Easy 載體、限制性內切酶和T4 DNA 連接酶購自Promega公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司(Sangon Biotech Co.,Ltd. Shanghai)合成。DNA凝膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司 (Tiangen Biotech Co., Ltd. Beijing)。其他生化試劑均為國產分析純。

圖1 表達載體pBI121T-DNA結構示意圖Fig.1 T-DNA structure diagram of expression vector pBI121 RB，LB：T-DNA 的右邊界序列和左邊界序列 The right border sequence and the left border sequence of T-DNA；NOS-pro，NOS-ter：NOS基因啟動子和終止子 NOS promoter and terminator；nptII(Kan’)：卡那霉素抗性基因 Kanamycin resistance gene；HindⅢ， BamHⅠ：HindⅢ和BamHⅠ限制性內切酶 HindⅢ and BamHⅠrestriction sites；CaMV 35S：花椰菜花葉病毒基因的啟動子 Cauliflower mosaic virus gene promoter；GUS：β-葡糖醛酸酶基因 β-glucuronidase gene；ATG，TGA：GUS基因的轉錄起始密碼子和終止密碼子 GUS gene transcription.

1.3 材料處理

用自來水沖洗試管微型薯，選擇平均直徑約為8 mm的微型薯分為2組，均保存在15℃黑暗培養(yǎng)箱。其中一組用錫箔紙包裹作為黑暗對照，另一組用15 W的紅燈泡照射(19.6～19.7 mol/m2·s)。分別在6，12，24 h后收集樣品并立即液氮處理后放在—80℃冰箱待用，以新鮮收獲的微型薯作為對照。

1.4 總RNA提取及其反轉錄

從冷凍的微型薯中提取總RNA，具體操作根據 Simple Total RNA 試劑盒的說明 (Tiangen Biotech CO., LTD Beijing) ?？俁NA 的濃度測定用 Ultrospec 1100 pro 分光光度計 (Amersham Biosciences)，用260/280 nm 的吸光值檢測RNA的質量，其完整性用1% 的瓊脂糖膠電泳檢測[12]。定量400 ng RNA 進行反轉錄，具體操作根據 PrimeScript?RT reagent Kit (TaKaRa Biotechnology Co., Ltd Dalian) ，其中包括基因組DNA的去除。

1.5 實時定量PCR

實時定量PCR以馬鈴薯延伸因子(ef1-α) 作為看家基因，馬鈴薯SGT3基因作為目的基因，其cDNA序列均從GenBank 數據庫 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得，引物設計用Primer Premier 5.0 (PREMIER Biosoft International) 軟件完成(表1)。實時定量PCR用SYBR GreenⅠ作染料， Mx3005p Multiplex Quantitative PCR System (Stratagene) 完成整個實驗，用20 μL反應體系，如下：10 μL 2×SYBR?Premix Ex TaqTM(TaKaRa Biotechnology Co., Ltd Dalian)，0.4 μL ROX Reverence Dye (50X)，1 μL cDNA，上下游引物的終濃度均為0.4 μmol/L，循環(huán)體系為：95℃ 30 s，40個循環(huán)(95℃ 5 s, 60℃ 30 s)，以溶解曲線檢查產物擴增的特異性：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。所有樣品重復3次，取平均值，實時定量PCR體系做2～3次重復以保證體系的穩(wěn)定性。最終PCR產物用2% 瓊脂糖膠電泳分離，證實產物的特異性。 CT 值通過Mx3005p Multiplex Quantitative PCR System 得出，用Excel 2003進行數據分析，SPSS 17.0 軟件對數據進行鄧肯法多重性顯著性分析。相對表達量用ΔΔCT法計算[13]。即相對表達量=2-ΔΔCT，其中ΔΔCT=CT (未知—看家基因)—CT (對照—看家基因)。

表1 實驗所需引物序列Table 1 Primer sequences used for this work

注：其中ef1-α和SGT3分別代表實時定量的內參基因引物和目的基因引物。P1，P2，P3，P4和P5分別代表5個缺失片段的上游引物和1個下游引物(R)。下劃線代表酶切位點HindⅢ和BamHⅠ，前面為保護堿基。

Note： ef1-α and SGT3 represents the reference gene primer and the target gene primers respectively. P1, P2, P3, P4 and P5 stand for five missing fragment forward primer and a common reverse primer. Underlined sequences indicate the HindⅢ and BamHⅠ sites。

1.6 馬鈴薯SGT3基因啟動子的序列分析

啟動子序列分析采用PLANTCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/) 和PLACRE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html) 軟件分析。

1.7 5′端各缺失片段的獲得和T中間載體的構建

利用Primer Premier 5.0 (PREMIER Biosoft International) 軟件設計5個缺失片段上游引物(P1，P2，P3，P4和P5)和1個通用下游引物(R)(表1)，為方便后續(xù)表達載體構建，在上游引物和下游引物5′分別插入HindⅢ (CCCAAGCTT) 和BamHⅠ (CGGGATCC) 酶切位點(表1)。以SGT3啟動子全序列質粒DNA為模板，按以下條件進行PCR擴增：反應體積為 20 μL，包括 1 μL DNA 模板，10 μL 10×DNA Mix，1 μL上游引物(10 mmol/L)，1 μL 下游引物(10 mmol/L)，7 μL ddH2O；反應條件為：95℃預變性 5 min；95℃ 5 s，55℃ 1 min；72℃ 1 min；35個循環(huán)后于72℃保溫延伸10 min，得到5個目標片段 (349，572，979，1312 和1870 bp)。經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后用DNA凝膠回收試劑盒回收純化，將得到不同長度的PCR產物連接到pGEM?-T Easy載體，經過藍白斑篩選，通過PCR檢測和酶切檢測 (HindⅢ和BamHⅠ) 選擇合適的菌體，測序結果用DNAMAN軟件進行序列比對，其相似性均達到99%以上。將測序合適的5個菌體(P349，P572，P979，P1312和P1870)提取質粒DNA，用HindⅢ/BamHⅠ雙酶切，得到5個小片段；同時用這兩種酶雙酶切pBI121質粒，得到切去 CMV 35S 啟動子的 pBI121 大片段。將5個小片段分別和pBI121大片段連接，得到不同長度的SGT3p/GUS的5個植物表達載體,分別命名為P349, P572，P979，P1312和 P1870 (圖2)。以CMV 35S驅動的pBI121作為陽性對照。該載體導入感受態(tài)大腸桿菌DH5α細胞，可利用pBI121上的nptII基因的卡那霉素抗性進行重組體轉化菌的篩選。用HindⅢ和Bam HI雙酶切驗證該重組體。

1.8 煙草的穩(wěn)定遺傳轉化和瞬時表達

采用農桿菌介導的煙草葉盤法[14]將構建好的5個缺失片段表達載體(P349, P572，P979，P1312和P1870)進行遺傳轉化，通過生根篩選，1個月后取頂部第 3 個葉片進行GUS組織化學染色，以非轉基因煙草為陰性對照 (CK-)，CMV 35S啟動子驅動的GUS基因的pBI121轉化煙草作為陽性對照 (CK+)。瞬時表達將共培養(yǎng)完畢后的煙草葉片在加入250 mg/L的頭孢無菌水中脫菌2 h，進行GUS組織化學染色，照相并觀察。以非轉基因煙草葉片為陰性對照(CK-)，CMV 35S啟動子驅動的GUS基因的pBI121轉化煙草作為陽性對照 (CK+)。

圖2 SGT3基因啟動子驅動報告基因GUS的融合表達載體構建Fig.2 Construction of GUS fusion expression vector driven by SGT3 promoter

1.9 GUS組織化學染色

參照張寧[15]的方法進行GUS染色，將轉基因煙草的頂部第 3 個葉片、莖和根進行GUS染色，至少選取5株獨立植株進行鑒定。37℃保溫過夜，用70%的乙醇沖洗4～5次，待陰性對照為白色，將植物的莖切取橫截面，放在載玻片上在正置萬能顯微鏡(OLYMPUS BX61)下進行觀察并照相，植物的葉片和根可以直接放在載玻片上觀察。以非轉基因煙草為陰性對照(CK-)。本實驗于2012年4月-2013年3月在甘肅農業(yè)大學作物遺傳改良與種質創(chuàng)新重點實驗室完成。

2 結果與分析

2.1 紅光顯著誘導SGT3基因的表達

圖3 SGT3基因表達特點Fig.3 The SGT3 gene expression B表示暗培養(yǎng)；R表示紅光誘導；*表示在0.05水平差異顯著。B denotes the dark treatment; R denotes red light induced; * indicates a significant difference at the 0.05 level.

將收獲的微型薯通過紅光誘導，用實時定量PCR方法測定在處理后6，12和24 h時SGT3基因的相對表達量。結果顯示，SGT3基因在15℃黑暗處理12 h，其微型薯的mRNA水平有所升高，但隨著時間的增加并無上升趨勢，在處理24 h后反而有所降低，說明在黑暗處理下，隨著時間的變化SGT3的含量沒有明顯改變。在紅光誘導6 h后，與黑暗對照相比，SGT3的表達量增加，T-test結果表明在0.05水平上其差異不顯著；在紅光誘導24 h后，SGT3的轉錄水平較黑暗對照增加了26.8倍，且在0.05水平上差異顯著，這說明紅光明顯誘導SGT3基因的表達，尤其在紅光誘導24 h后表達量顯著增加(圖3)。

2.2 SGT3啟動子的序列分析

圖4 擴增SGT3基因啟動子Fig.4 Amplification result of SGT3 gene promoter

圖5 SGT3基因的啟動子序列Fig.5 Sequence of SGT3 gene promoter 下劃線表示構建缺失片段的5個上游引物和1個下游引物；ATG的A記為+1位點，起始密碼子ATG，TATA-Box，CAAT-Box均用灰色表示，部分光調控元件用粗體表示。 →代表預測的轉錄起始位點。The underlined sequences are five forward primers and one reverse primer; the start codon，TATA-Box and CAAT-Box are highlighted in grey; some elements of light regulation are shown in bold; transcription start site is shown in black arrow →.

調控序列名稱Regulatory sequence name序列Sequence位置Position功能Function參考文獻ReferenceTATABOXTATATAA-935(+),-194(+),-301(-),-201(-)核心啟動子元件Core promoter ele-ment[17]CAATBOXCAAT-442(+),-419(+),-218(+)增強子Enhancer element[18]GATABOXGATA-209(+),-796(+)增強子Enhancer element[19]WRKY710STGAC-1796(+),-328(+),-235(+)抑制子Repressor element[20]5′UTRPY-RICH STRETCHTTTCTCTCTCTCTC-970(+)高轉錄區(qū)High transcription levels[21]ABRELATERD1ACGTG-1641(+)增強子與組織特異性Enhancer and tissue-specific element[22]ROOTMOTIFTAPOX1ATATT-419(+),-998(+),-1095(+)根特異性元件Root-specific element[23]WBOXATNPR1TTGAC-1797(+),-1708(-)病原體響應元件Pathogen-responsive element[24]BIHD10STGTCA-1846(+),-235(-)病原體響應元件Pathogen-responsive element[25]TC-RICH REPEATSATTTTCTCCA-1347(+)抗逆境脅迫元件Defense and stress responsiveness[26]MYB1ATWAACCA-1831(-),-1635(-)受干旱及激素ABA誘導Drought-and ABA-responsive element[27]MYCCONSENSUSATCANNTG-218(+),-27(+)受干旱及激素ABA誘導Drought-and ABA-responsive element[28]MYBCORECNGTTR-879(-),-844(-)受干旱及激素ABA誘導Drought-and ABA-responsive element[29]MYBGAHVTAACAAA-601(+),-305(-)糖抑制元件Sugar repression[30]PYRIMIDINEBOXOSRAMY1ACCTTTT-979(+),-171(+),-663(-)糖抑制元件Sugar repression[31]SREATMSDTTATCC-1437(-)糖抑制元件Sugar repression[32]ACECTAACGTATT-588(+)光響應元件Light responsivenessATCT MOTIFAATCTAATCT-468(+)光響應元件Light responsivenessIBOXGATATGG-796 (+)光響應元件Light responsiveness[33]SP1CCACCC-1139(+)光響應元件Light responsiveness[34]PALBOXAPCCCGTCC-1851(+)光響應元件Light responsiveness[35]-10PEHVPSBDTATTCT-608(-)光調控元件Light regulation[36]IBOXCOREGATAA-1436(+),-473(+),-209(+),-1602(-),-1507(-),-369(-)光調控元件Light regulation[33]TBOXATGAPBACTTTG-1800(+),-1384(+),-1706(-)抑制光激發(fā)基因的轉錄Reductions of light-activated gene transcription[37]

為了探索SGT3基因的光誘導原理，本實驗將克隆到2449 bp的潛在SGT3啟動子(圖4箭頭所示)，通過序列分析發(fā)現該片段的3′端與已報道的SGT3基因cDNA 5′端完全相同(57 bp)，將此序列在GenBank數據庫中進行Blast對比，發(fā)現此啟動子序列為首次克隆到，并且與馬鈴薯染色體11上的RH170D10同源性達到98%，說明克隆到的是SGT3 編碼起始密碼子ATG的上游序列。通過Core promoter軟件(http://rulai.cshl.org/tools/genefinder/CPROMOTER/human.htm)在線預測該啟動子的起始位點，初步確定轉錄起始位點為翻譯起始密碼子上游-152 bp處的 “A” 堿基。將SGT3基因啟動子序列在植物順式作用元件數據庫 PLANTCARE和PLACE中進行生物信息學分析，發(fā)現在翻譯起始密碼子上游-194和-935處可能存在2個TATA-box，同時確定了3個CAAT-box的位置(圖5)，在該啟動子序列-970處有1個賦予SGT3基因高轉錄水平(high transcription levels)的5′UTR Py-rich stretch元件和3個糖抑制元件(Sugar repression)(表2)。研究表明SGT3基因的合成受到多種環(huán)境因素調控[16]，本實驗通過數據庫搜索,預測到SGT3基因啟動子中含有多個受干旱和受ABA誘導 (drought-和ABA-responsive)、病菌誘導(pathogen-responsive) 等調控元件,同時對啟動子的組織特異性元件(tissue-specific element)、增強子元件(enhancer element) GATAbox、抑制子元件(repressor element)也進行了預測, 另外在此DNA序列及其互補鏈中分布著許多與光調控相關的順式作用元件, 其中包括典型的光應答元件：ACE,ATCTMOTIF,IBOX，-10PEHVPSBD等 (表2)，但對于這些調控元件的功能還有待于進一步的實驗證明。

圖6 不同缺失片段表達載體雙酶切鑒定圖Fig.6 Double digestion detection of expression vector driven by SGT3 promoter

2.3 不同長度的SGT3啟動子驅動GUS基因在煙草愈傷組織中的瞬時與穩(wěn)定表達

利用煙草葉片浸染法[38]分別將構建好的植物表達載體P349, P572，P979，P1312、P1870(圖6)及CMV 35S啟動子驅動的陽性對照導入煙草愈傷組織。通過GUS組織化學染色發(fā)現，5種不同長度的SGT3都能驅動GUS基因的表達，但表達水平存在差異，在P572，P979的表達強度較高，在 P1312和P1870明顯減弱。而且不同長度SGT3啟動子驅動的愈傷組織的GUS表達水平沒有陽性對照CMV 35S驅動的表達量高，非轉化愈傷組織中無GUS表達(圖7A)。

為了進一步分析SGT3基因在煙草中的穩(wěn)定遺傳表達，采用葉盤法[14]將5個不同缺失片段的GUS融合表達載體導入煙草葉片，經過愈傷組織分化和生根篩選，得到穩(wěn)定表達的煙草組培苗。選取頂部第 3 個葉片進行GUS染色。結果顯示，所有轉基因煙草葉片均變藍，未轉基因煙草葉片不變色，說明陽性對照及其5種不同長度SGT3驅動的GUS基因均成功轉入煙草，但其表達水平存在顯著差異。其中P572片段驅動的轉基因煙草GUS表達量較高，P1870片段驅動的轉基因煙草表達量較低。但5種不同長度的SGT3驅動GUS轉基因煙草的表達均沒有陽性對照pBI121中CMV 35S啟動子驅動的表達量高(圖7B)，這與瞬時表達結果一致。這證明了SGT3基因啟動子和CMV 35S啟動子已轉化進入到煙草植株基因組中,并能在正常光照條件下誘導驅動GUS基因的表達，說明SGT3啟動子的活性沒有CMV 35S啟動子的活性強。

2.4 不同組織中SGT3驅動GUS基因的特異性表達

通過煙草的瞬時表達和遺傳穩(wěn)定表達，發(fā)現P572片段驅動的GUS在轉基因煙草中的表達量較高，將其頂部第 3 個葉片、莖和根進行GUS染色，放在正置萬能顯微鏡下觀察其組織特異性。在煙草葉片中，GUS染色主要集中在煙草葉片的葉脈部分，而葉肉細胞GUS染色不明顯(圖8C)。莖中GUS染色主要分布在表皮、韌皮部及木質部，其中GUS表達量在木質部最高，在髓部幾乎不表達(圖8B)。根中主要分布在根冠、分生區(qū)以及維管束組織中(圖8A)。以上結果說明SGT3基因啟動子驅動的GUS基因主要表達在分生組織或維管束組織中。

3 討論

SGT3作為糖苷生物堿末端合成酶，對調控茄堿的表達有至關重要的作用，而啟動子是精確調控外源基因在植物體內表達的重要元件[39]。本實驗首先通過紅光誘導，發(fā)現當紅光和黑暗同時處理馬鈴薯試管薯6～12 h后，SGT3的表達量沒有顯著變化。 而當紅光處理24 h后，SGT3的表達量顯著增加，而且研究發(fā)現紅光顯著誘導SGA含量的增加[7]，因此紅光可能誘導了SGT3基因的表達進而導致SGA含量增加。

本項研究的結果同時暗示了糖苷生物堿在光下含量高[7]的原因可能與SGAs合成代謝相關基因的調控密切相關。為進一步探究其調控原理，首次從馬鈴薯栽培種克隆到SGT3啟動子，通過信息學分析初步預測該啟動子的起始位點位于翻譯起始位點上游-152 bp處，其準確性則需要通過進一步試驗驗證。序列分析發(fā)現SGT3啟動子序列存在大量光調控元件，如ACE,ATCTMOTIF,IBOX，-10PEHVPSBD。煙草的愈傷組織瞬時表達和煙草穩(wěn)定遺傳結果表明：不同長度SGT3驅動的GUS基因均在煙草的愈傷組織和轉基因葉片中表達，但其表達強度沒有陽性對照pBI121的表達量高，說明所研究SGT3啟動子的驅動活性沒有啟動子CMV 35S的活性強,研究表明馬鈴薯SGT2啟動子驅動的轉基因植株的表達量也沒有CMV 35S啟動子驅動的轉基因植株的表達量高[11]。在缺失片段驅動的GUS煙草愈傷組織和轉基因葉片中發(fā)現，P572和P979表達量較高， 序列分析結果表明在該片段存在加強子(-796)和高轉錄區(qū)(-970),以及光調控元件ACE(-588)和IBOX(-796)。已知ACE和IBOX是光誘導基因啟動子中普遍存在的光應答元件(LREs)，它們對光調控的轉錄激活是必需的[40-42]，這可能是P572和P979驅動的GUS基因表達量高的原因，也說明此段區(qū)域是啟動子調控的關鍵序列部分，預測結果與瞬時表達和煙草的穩(wěn)定表達結果均一致。而P1312和P1870的表達量減弱，序列分析發(fā)現，在此片段存在抑制子(-1796)和 TBOXATGAPB(-1800和-1384),據報道TBOXATGAPB是抑制光激活基因轉錄的元件[37]，它能有效地調控光調控元件的表達，同時由于啟動子自身序列長度的增加，減弱了啟動子的活性。SGT3基因的啟動子與GUS組成的融合表達基因(SGT3p/GUS)在煙草的分化部位以及疏導組織中有比較高的表達，可能與這些部位特殊的疏導作用相關，其疏導作用最終亦要以跨膜運輸的方式進行，而通過TMHMM 2.0軟件對SGT3蛋白的跨膜區(qū)預測發(fā)現，該蛋白在50AA處存在跨膜結構。這進一步證實了SGT3啟動子表達的組織特異性。

圖7 煙草葉片不同缺失片段GUS染色Fig.7 GUS expression in tobacco driven by the promoters of SGT3 and CMV 35S A.瞬時表達；B.T1代。CK- 代表未轉基因煙草葉片；CK+、P349、P572、P979、P1312和P1870分別表示轉pBI121、P349、P572、P979、P1312和 P1870的煙草葉片GUS 組織化學檢測結果。A: Transient expression; B: T1 generation. CK- represents not genetically modified; CK+, P349, P572， P979, P1312 and P1870 shown GUS histochemical assay of tobacco leaf transformed with P349, P572, P979, P1312 and P1870, respectively.

圖8 P572驅動的GUS基因在煙草根、莖和葉片中的穩(wěn)定表達Fig.8 Stable expression of GUS gene in root、stem and leaves driven by P572A.根 Root; B.莖 Stem;C.葉片 Leaf.

瞬時表達不能將轉染的核酸整合到染色體上，結果只是短暫的高水平的表達，因此也就無法精確定位轉染核酸表達的位置，同時由于DNA的攝入效率和表達水平在不同試驗中差異較大，不長久也不穩(wěn)定，得到的蛋白質保存時間也比較短。本實驗通過比較煙草葉片侵染瞬時表達和穩(wěn)定遺傳表達，發(fā)現瞬時表達還是有一定的可靠性，在煙草葉片中不同長度SGT3啟動子驅動的GUS基因的瞬時表達和葉盤轉化法的煙草穩(wěn)定表達結果基本一致，但是煙草穩(wěn)定表達更能確定地從植物遺傳學角度去分析問題，它將核酸和染色體整合到一起，但整合并不一定意味著表達，只有整合到表達區(qū)的基因才會表達，而且整合到不同的染色體區(qū)段的外源基因表達的量也是不同的，所以還需通過生根篩選等新表型篩選穩(wěn)定轉染體，得到穩(wěn)定表達的植株。

目前，已得到以上5種不同長度SGT3基因上游序列驅動的GUS基因表達的轉基因植株，之后可以對各轉基因植物進行光誘導和干旱、ABA、真菌侵染以及糖抑制等啟動子活性檢測，以便對該啟動子功能做更細致的分析，從而進行啟動子的合理改造, 如在保留其核心元件和功能元件的前提下，改變其組織特異性功能元件，提高其表達活性，更好地應用于生物工程研究中，獲得葉片中SGAs含量高而塊莖中其含量低的優(yōu)良馬鈴薯品種。