張 寧，蔣劍春，楊 靜，衛(wèi) 民，趙 劍 ，童婭娟

(中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所;生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室;國家林業(yè)局林產(chǎn)化學(xué)工程重點開放性實驗室;江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室，江蘇 南京 210042)

纖維素酶是一種多組分的復(fù)合酶，現(xiàn)在己經(jīng)確定纖維素酶含有3種主要組分，即內(nèi)切葡萄糖苷酶(EC3.2.1.4 EG)、外切葡萄糖苷酶(EC3.2.1.91CBH)和纖維二糖酶(EC3.2.1.21 BG)。在纖維素水解過程中首先由內(nèi)切葡萄糖苷酶在纖維素鏈內(nèi)部水解，降低其聚合度，然后由外切葡萄糖苷酶作用于非還原性末端釋放出纖維二糖;最后由纖維二糖酶將纖維二糖水解為葡萄糖［1］。有多種微生物能夠產(chǎn)生纖維素酶，例如好氧絲狀真菌，好氧放線菌，厭氧嗜熱細(xì)菌和厭氧真菌等［2］。迄今為止，產(chǎn)纖維素酶能力最強的常用的微生物是里氏木霉［3-4］，其纖維素酶產(chǎn)量高，所產(chǎn)的纖維素酶是胞外酶，易與菌體分離純化而得到所需的酶，里氏木霉及其代謝產(chǎn)物安全無毒，不會影響生產(chǎn)人員和環(huán)境。利用纖維素酶轉(zhuǎn)化纖維素原料制糖，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為燃料乙醇、燃?xì)獾饶茉次镔|(zhì)已成為當(dāng)今世界的研究熱點［5-6］。

固態(tài)發(fā)酵是一種具有節(jié)水、節(jié)能、產(chǎn)率高、排放低等獨特優(yōu)勢的清潔生產(chǎn)技術(shù)，采用固態(tài)發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)纖維素酶比液體深層發(fā)酵具有較多優(yōu)勢［7］:發(fā)酵環(huán)境更接近于自然狀態(tài)下的木霉生長習(xí)性，產(chǎn)生的酶系更全，有利于降解天然纖維素;固態(tài)發(fā)酵消耗能源少，設(shè)備投資相對減少;酶產(chǎn)品收率高，后續(xù)提取過程較液態(tài)發(fā)酵好處理［8］。故纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn)一般采用固態(tài)發(fā)酵法。

本文作者應(yīng)用實驗室誘變篩選得到的纖維素酶高產(chǎn)突變株T.reesei150-1-1［9］發(fā)酵制備纖維素霉固體曲，研究固態(tài)發(fā)酵條件對產(chǎn)酶的影響并對其進(jìn)行優(yōu)化，從而為發(fā)酵制備纖維素酶固體曲提供技術(shù)依據(jù)。

1 實驗

1.1 菌種

纖維素酶高產(chǎn)菌株里氏木霉T.reesei150-1-1，本實驗室篩選獲得［9］。

1.2 固體培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。

1.3 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基

按不同質(zhì)量比稱取原料麩皮和秸稈粉共10 g，添加不同體積的營養(yǎng)溶液，其組成為:硫酸銨1%，磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂0.05%，并用檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基至不同pH值，于121℃滅菌60 min，冷卻備用。

1.4 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件的確定

將用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的種子接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，依次考察麩皮與秸稈粉的配比、料液比、發(fā)酵時間、溫度和初始pH值對產(chǎn)酶的影響，并用其優(yōu)化值逐個替代初始工藝中相應(yīng)值，初步確定固態(tài)發(fā)酵條件。發(fā)酵結(jié)束后提取纖維素酶，并測定固體曲纖維素酶活力。每項試驗做3個平行樣，取平均值。然后通過3因素3水平正交試驗確定最佳產(chǎn)酶條件。

1.5 分析方法

1.5.1 粗酶的提取 取培養(yǎng)適當(dāng)?shù)睦w維素酶固體曲5.0 g，加pH值為4.8的醋酸-醋酸鈉(HAC-NaAC)緩沖液45 mL，酶液浸提方法為:搖床上30℃浸提1 h，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為95 r/min。之后用中速定性濾紙及真空泵抽濾，濾液即為用于測定的酶液。

1.5.2 纖維素酶活力的測定 還原糖法測定固體曲酶活力［10］。固體曲酶活力單位(U)定義為每小時產(chǎn)生1 μmoL還原糖(以葡萄糖計)所需酶量，樣品的酶活力用每克濕曲所含的酶活力單位數(shù)(U/g)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶固體曲發(fā)酵培養(yǎng)基組成的研究

2.1.1 麩皮與秸桿粉用量對產(chǎn)酶的影響 麩皮與秸稈粉用量對固體曲酶活力的影響實驗結(jié)果見圖1。結(jié)果表明固體曲纖維素酶活力隨著麩皮用量的增加、秸稈粉用量的減少先增加后略有降低，在麩皮與秸稈粉的比例為4∶1時酶活力達(dá)到最大值，與文獻(xiàn)［11］報道結(jié)果一致。這可能是由于麩皮中富含淀粉、纖維素、半纖維素、有機氮及生長因子，這些營養(yǎng)物質(zhì)可促進(jìn)菌絲的生長，其中纖維素和半纖維素對酶的合成具有誘導(dǎo)作用，而加入適量的秸稈粉增加了培養(yǎng)基中纖維素和半纖維素的含量，進(jìn)一步誘導(dǎo)了纖維素酶的合成和分泌［12］。

2.1.2 培養(yǎng)基料液比對產(chǎn)酶的影響 不同料液比(質(zhì)量比)對產(chǎn)酶影響的實驗結(jié)果見圖2，由圖2可知，培養(yǎng)基中的水分對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶有較大影響。水分少，菌絲體前期長勢良好，但后期生長所需水分和營養(yǎng)供應(yīng)不足，纖維素酶活力下降;水分太多使得菌絲體前期陡長，形成孢子時間較長，同時透氣性下降，氧供給不足，影響菌體生長，也導(dǎo)致纖維素酶活力下降。在本研究中適宜T.reesei150-1-1產(chǎn)酶的料液比為 1∶2.5。

圖1 麩皮和秸桿粉用量對酶活力的影響Fig.1 Effect of ratio between wheat bran and straw powder on cellulase activities of solid koji

圖2 培養(yǎng)基料液比對酶活力的影響Fig.2 Effect of ratio of materials to liquid on cellulase activities of solid koji

2.2 纖維素酶固體曲發(fā)酵條件的研究

2.2.1 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響 T.reesei150-1-1發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶需要一定的時間，從圖3可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，纖維素酶活力先慢慢增加;發(fā)酵時間為120 h時，纖維素酶活力達(dá)到最大值;再繼續(xù)延長發(fā)酵時間，纖維素酶活力顯著降低。這可能是由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分耗盡，菌體停止代謝活動，有效發(fā)酵也就停止了。因此要得到酶活力較高的纖維素酶，控制發(fā)酵時間是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。T.reesei150-1-1適宜發(fā)酵時間為120 h。

2.2.2 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響 從圖4可以看出，溫度對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶也有影響。在溫度低于31℃的條件下，隨著溫度升高纖維素酶活力有所增大，31℃時纖維素酶活力達(dá)到最大，在高于31℃的條件下，纖維素酶活力則逐漸下降。微生物最適生長溫度可能是由溫度對生物體內(nèi)無數(shù)個酶反應(yīng)的綜合作用決定的，微生物在最適生長溫度以上生長速率降低，酶活力下降，可能是一些限速酶或其它酶的變性導(dǎo)致的。因此，對T.reesei150-1-1來說，適宜產(chǎn)酶的溫度為31℃。

圖3 發(fā)酵時間對酶活力的影響Fig.3 Effect of fermentation time on cellulase activities of solid koji

2.2.3 培養(yǎng)基初始pH值對產(chǎn)酶的影響 環(huán)境pH值可引起細(xì)胞膜電荷的變化，從而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，影響代謝過程中酶的活性，改變營養(yǎng)物質(zhì)的可給性和有害物質(zhì)的毒性;而微生物代謝活動會改變環(huán)境pH值，所以培養(yǎng)基中往往要加緩沖劑。固體曲培養(yǎng)基用檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)初始pH值至4.2～6.6，考察初始pH值為 4.2、4.6、5.0、5.4、5.8、6.2 和 6.6 對固體曲酶活力的影響，實驗結(jié)果見圖5，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值在4.2～5.0之間的條件下，隨著pH值的升高固體曲纖維素酶活力顯著增加;在pH值為5.0～6.6的條件下，隨著pH值升高，纖維素酶活則呈下降趨勢。在初始pH值為5.0時，T.reesei150-1-1產(chǎn)酶能力最強。

圖4 發(fā)酵溫度對酶活力的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on cellulase activities of solid koji

圖5 培養(yǎng)基起始pH值對酶活力的影響Fig.5 Effect of pH value on cellulase activities of solid koji

2.3 正交試驗優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件 采用L9(33)正交表，考察發(fā)酵溫度(A)、發(fā)酵時間(B)和初始pH值(C)對固體曲纖維素酶活力的影響，試驗結(jié)果見表1。由表1可知，發(fā)酵時間對纖維素酶活力的影響最大，其次是發(fā)酵溫度，影響最小的是初始pH值，即3因子對纖維素酶活力的影響順序為發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度＞初始pH值，酶活力最高的發(fā)酵條件組合是A2B3C3，即:發(fā)酵溫度為31℃，發(fā)酵時間為120 h，初始pH值為5.5。經(jīng)3次驗證，在該反應(yīng)條件下發(fā)酵得到的纖維素酶濾紙酶活為423.6 U/g。

表1 正交試驗設(shè)計及試驗結(jié)果分析Table 1 Design of orthogonal experiment list and the result analysis of test

3 結(jié)論

應(yīng)用本實驗室篩選得到的纖維素酶高產(chǎn)菌株T.reesei150-1-1發(fā)酵制備纖維素酶固體曲，通過正交試驗優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件，制備得到纖維素酶活力較高的固體曲及粗酶液。

3.1 應(yīng)用里氏木霉150-1-1制備纖維素酶固體曲的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中麩皮與秸桿粉的最佳質(zhì)量比為4∶1，最佳料液比為 1∶2.5。

3.2 應(yīng)用里氏木霉150-1-1制備纖維素酶固體曲的最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度31℃，發(fā)酵時間120 h，發(fā)酵起始pH值5.5，在此條件下發(fā)酵得到的纖維素酶固體曲酶活力達(dá)到423.6 U/g。

［1］史通，宋向陽，歐陽嘉，等.黑曲霉與里氏木霉混合發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2013，33(5):101-105.

［2］LHND L R，WEIMER P J，VANZYL W H，et al.Microbial cellulose utilization:Fundamentals and biotechnology［J］.Microbiology and Molecular Biology Reviews，2002，66(3):506-577.

［3］江小華，朱均均，余世袁，等.里氏木霉β-木糖苷酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)及水解機理研究［J］.生物質(zhì)化學(xué)工程，2013，47(1):27-32.

［4］衛(wèi)民，趙劍，劉軍利，等.植物纖維原料水解生產(chǎn)乙醇的研究進(jìn)展［J］.生物質(zhì)化學(xué)工程，2013，47(3):48-51.

［5］YAN Shou-bao，LI Jun，CHEN Xiang-song，et al.Enzymatical hydrolysis of food waste and ethanol production from the hydrolysate［J］.Renewable Energy，2011(36):1259-1265.

［6］YANG Hui，CHEN Li，YAN Zong-cheng，et al.Emergy analysis of cassava-based fuel Ethanol in China［J］，Biomass and Bioenergy.2011，35，581-589.

［7］丁重陽，王玉紅，章克昌.箱式固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的研究［J］.釀酒，2003，30(2):33-35.

［8］班靖洋，張栩，譚天偉.以甜高粱渣為原料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇［J］.北京化工大學(xué)學(xué)報，2007，34(6):637-639.

［9］張寧，蔣劍春，楊靜，等.N+注入誘變選育纖維素酶高產(chǎn)菌株及發(fā)酵產(chǎn)酶營養(yǎng)因子優(yōu)化研究［J］.生物質(zhì)化學(xué)工程，2014，48(4):28-34.

［10］GHOSE T.Measurement of cellulase activities［J］.Pure and Applied Chemistry，1987，58(2):257-268.

［11］王箐莎，王頡，周家楠，等.里氏木霉LW1固態(tài)發(fā)酵纖維素酶條件的研究［J］.生物學(xué)雜志，2006，23(3):32-36.

［12］饒慶隆，杭志喜，彭軍，等.里氏木霉產(chǎn)纖維素酶碳源優(yōu)化［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，30(3):528-542.