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        一個非綜合征性耳聾家系的GJB2基因突變分析及產前診斷

        2014-11-05 01:19:42陳曉華余小艷周潔姜威胡俊鐘山楊國華
        解放軍醫(yī)學雜志 2014年7期
        關鍵詞:證者家系耳聾

        陳曉華,余小艷,周潔,姜威,胡俊,鐘山 ,楊國華

        耳聾出生缺陷是影響我國出生人口素質的重要問題之一[1],2006年12月第二次全國殘疾人抽樣調查結果顯示,耳聾位居我國各類殘疾之首,聽力殘疾者高達2780萬,且每年以3萬聾兒的新發(fā)速度在增長[2],約60%的先天性耳聾由遺傳性因素導致[3]。非綜合征性耳聾(non-syndromic hearing impairment,NSHI)占遺傳性耳聾的70%,約77%的NSHI為常染色體隱性遺傳[4-5]??p隙連接蛋白2(gap junction protein beta-2,GJB2)基因突變是常染色體隱性遺傳聽力損失的主要原因之一[6],約有50%的常染色體隱性遺傳NSHI患者存在該基因突變[7]。目前已知的與耳聾有關的GJB2基因突變位點有100多個,其中235delC突變在東亞人群發(fā)生頻率較高[8]。在耳聾基因診斷的臨床工作中,我們發(fā)現(xiàn)一個同時攜帶GJB2 235delC和176-191del16bp的家系,對此家系相關成員的基因型進行了分析,并對孕婦進行產前診斷。

        1 資料與方法

        1.1 研究對象 樣本取自湖北孝感市中心醫(yī)院婦產科。孕婦(Ι-2)33歲,身體健康,受檢時妊娠20周,孕期常規(guī)體檢未見異常,其第一胎為先證者(Ⅱ-1),男,7歲,漢族,智力正常,出生后即無聽力、無語言能力,心、腦、腎等器官無異常。孕婦丈夫(Ι-1)32歲,身體健康。夫婦二人已育有一子,即為耳聾先證者(Ⅱ-1),第二胎(Ⅱ-2)胎齡20周,家系譜見圖1。

        圖1 患者家系圖Fig. 1 Pedigree of the non-syndromic deafness family

        1.2 研究方法

        1.2.1 臨床聽力學檢測 對先證者進行電耳鏡檢查、純音測聽、聲導抗檢測及顳骨CT掃描檢查。以2003年《關于非綜合征型遺傳性聽損傷家系遺傳學及聽力學描述術語建議案》為耳聾診斷標準,耳聾程度按照兩耳中聽力較好耳的平均聽閾(0.5~4.0kHz聽閾的平均值)來評估: ≤20dB HL為正常;20~40dB HL為輕度聽力損失;41~70dB HL為中度聽力損失;71~95dB HL為重度聽力損失;>95dB HL為極重度聽力損失。

        1.2.2 家系所有成員GJB2基因型測序及比對

        1.2.2.1 基因組DNA抽提 取得該家系成員書面同意后,抽取該家系成員Ι-1、Ι-2、Ⅱ-1外周抗凝血各2ml,應用蛋白酶K法提取白細胞基因組DNA;超聲引導下行羊膜腔穿刺術抽取孕婦羊水20ml,無菌培養(yǎng)羊水細胞1周后,應用蛋白酶K法提取羊水細胞基因組DNA。紫外分光光度計進行DNA定量與純度分析,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.2.2 PCR擴增GJB2基因 通過NCBI GenBank查詢到GJB2編碼區(qū)序列,利用Primer 5軟件設計引物。上游引物:5'-TTGGTGTTTGCTCAGGAAGA-3',下游引物:5'-GGCCTACAGGGGTTTCAAAT-3',產物大小為960bp。應用ABI 9700熱循環(huán)儀進行DNA擴增。反應體系為:10×Buffer 2.5 μl,dNTP 2.5μl,Taq酶2μl,10μmol/L上下游引物各1 μl,100ng DNA模版1 μl,ddH2O 15μl。反應條件:94℃預變性5min;94℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min,35個循環(huán);72℃延長10min。對擴增后產物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳粗測,結果顯示家系中所有成員均含有GJB2基因(圖2)。

        圖2 家系各成員GJB2基因PCR電泳圖Fig.2 GJB2 electrophoresis analysis of the family members

        1.2.2.3 PCR產物測序及TA克隆后測序 將PCR擴增產物用快速DNA產物純化試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)進行純化,送上海生工(Sangon)生物工程股份有限公司測序。采用上、下游引物雙向測序證實的序列變異認定為突變。針對測序圖出現(xiàn)的難辨雜峰,對擴增產物進行TA克隆后再挑取單克隆進行測序:將PCR純化后的擴增產物連接到pMDI8-T載體,連接產物轉化大腸埃希菌DH5α,每一產物挑取多個克隆菌落進行培養(yǎng),收集菌液,抽提質粒進行測序。在多個克隆中同時存在的序列變異認定為突變。

        1.3 序列比對 應用Bioedit軟件將測序結果與NCBI網站提供的人類GJB2基因標準序列(GenBank:AY280971.1;GI:33391196)進行比對。利用Omiga 2.0軟件對核酸序列進行分析。

        2 結 果

        2.1 聽力學檢測結果 純音電測聽檢查結果顯示,先證者左右耳聽力均大于71分貝,屬于重度耳聾。其聲阻抗檢查與純音電測聽檢查結果相符。顳骨CT顯示內耳結構及發(fā)育均無異常。全身檢查無其他系統(tǒng)異常,排除內耳及神經的占位病變。第二胎出生后住院期間聽力篩查雙耳通過,至今已10月齡,隨訪聽力完全正常。

        2.2 家系所有成員GJB2基因型測序及比對結果由圖3、4可見,測序結果顯示父親攜帶GJB2 176-191del16雜合突變,母親攜帶GJB2 235delC雜合突變。先證者分別遺傳了父母有突變的一條染色體,即同時攜帶235delC與176-191del16的復合突變,因此屬于GJB2復合突變引起的常染色體隱性遺傳耳聾。因其父母均為攜帶者,再生育聾兒的風險為25%。胎兒遺傳了母親有突變的第13號染色體,攜帶GJB2 235delC雜合突變,即一條染色體為GJB2 235delC,而另一條染色體正常,因此,僅為GJB2 235delC雜合突變攜帶者,發(fā)生耳聾的風險與正常人群相近,不同于先證者的基因型,不會復制先證者的聽力結構。

        圖3 先證者突變型測序圖Fig.3 Sequencing results of the mutant of the proband

        圖4 家系各成員GJB2 DNA序列比對Fig.4 GJB2 DNA sequence alignment of the family

        3 討 論

        GJB2突變所致的耳聾主要為先天性NSHI,為常染色體隱性遺傳模式。在中國人群中,已檢出由GJB2突變所致的兒童語前聾達到26%,占常染色體隱性遺傳性耳聾的28%[9-10]。世界不同地區(qū)的耳聾家系中均檢測到GJB2基因突變[11-17],其中重度耳聾新生兒的發(fā)病率達1/800~1/1000[2,18]。近期對不同年齡段NSHI常見基因進行檢測發(fā)現(xiàn),GJB2基因突變患者的發(fā)病年齡集中在1歲以內,所占比例高達66.67%[19]。由于兒童NSHI無其他組織器官異常表現(xiàn),因此很難及時篩查和早期干預[20]。本文家系父母均為聽覺正常的GJB2突變攜帶者,先證者同時攜帶父親的176-191del16bp和母親的235delC突變,出生即耳聾并喪失語言能力。胎兒基因檢測結果為GJB2基因235delC雜合突變,來源于其母親,因此胎兒為GJB2 235delC雜合突變攜帶者,耳聾風險與正常人群接近。后隨訪證實,該胎兒出生后通過雙耳聽力篩查,至今已10月齡,聽力完全正常。夫婦兩人為同一基因(GJB2)致病突變攜帶者,這類耳聾家庭在臨床中所占比例相對較小,但一旦發(fā)生,其孕育聾兒的風險將大幅提高。因此,必須注重與普及婚育前耳聾基因普遍性篩查,做好產前診斷及干預。

        GJB2基因編碼分子量為26.5kD的縫隙連接蛋白26(Connexin26,Cx26),定位于染色體13q11-12,基因組DNA全長4804kb,含有2個外顯子、1個內含子,其編碼區(qū)位于第2外顯子[21]。Cx26主要分布于內耳的血管紋、螺旋韌帶、螺旋緣及耳蝸的支持細胞之間,與相鄰細胞的間隙連接蛋白組成間隙連接通道,維持耳蝸中細胞間信息的正常傳遞和K+的正常循環(huán),保證耳蝸聽覺系統(tǒng)的正常功能[22-24]。GJB2基因發(fā)生突變可導致Cx26蛋白結構異常,縫隙連接缺損,通道不能正常開閉,使細胞間信號傳遞受阻或紊亂,從而引起感音神經性耳聾[21,25]。在我國,GJB2 235delC是NSHI患者的主要突變方式[16,26],對先天性耳聾患者進行突變篩查發(fā)現(xiàn),GJB2 235delC突變在先天性耳聾患者中所占比例為18.16%[27]。235delC突變位于Cx26蛋白第二跨膜區(qū),引起第79位密碼子移碼突變,導致終止密碼子提前至第82位,使所編碼的多肽只有81個氨基酸,比野生型蛋白截短了145個氨基酸,造成其間隙連接功能失活,產生了一個無功能的縫隙連接蛋白[28]。176-191del16bp突變是NSHI人群GJB2基因中僅次于235delC突變的另一種突變形式[29],可導致密碼子59-76的移碼改變,使終止密碼子提前,產生無功能蛋白,使K+經內耳毛細胞循環(huán)回流進入耳蝸內淋巴液的循環(huán)受到影響,最終導致耳聾的發(fā)生。該家系在分子水平上驗證了攜帶GJB2基因突變的耳聾為先天性耳聾的特點,提示在臨床上進行耳聾患者GJB2基因診斷時,應將235delC和176-191del16突變列為耳聾基因檢測的常規(guī)項目。

        GJB2基因突變所致的耳聾大多數(shù)為隱性遺傳,其系譜特點為:①患者的雙親表現(xiàn)型往往正常,但他們均為致病基因攜帶者,出生耳聾患兒的可能性約占1/4,患兒的正常同胞中有2/3的可能性為攜帶者;②系譜中看不到連續(xù)傳遞,即表現(xiàn)為散發(fā)病例,往往在整個系譜中只有先證者1例患者;③性狀的遺傳與性別無關;④近親婚配時,后代中發(fā)病率明顯增高。因此,在產前診斷中,如果發(fā)現(xiàn)胎兒攜帶2個GJB2基因的致病突變位點,則其發(fā)生耳聾的概率為100%。我們將家系的分析結果用于先證者家庭的產前篩查與產前診斷,避免了該家庭再次生育突變基因型的兒童。在我國的NSHI患者中,明確為GJB2基因突變引起耳聾的比例達到21.01%[29]。因此對GJB2基因突變導致耳聾的家庭進行遺傳咨詢、產前篩查和產前診斷顯得尤為重要。

        耳聾產前診斷應盡可能在孕早期進行,早期得到診斷結果,早期進行生育選擇,避免痛苦較大的中后期引產。此外,母親最好提前進行遺傳咨詢,在耳聾遺傳風險以及致聾基因型確定之后再懷孕,以免造成不良后果[30]。此例家庭的胎兒只攜帶了來自母親的235delC雜合突變,未導致聽力異常是幸運的,但懷孕前未進行遺傳咨詢或檢查時間較晚則不可取。接受產前診斷時,應根據母親妊娠的不同時期選擇適當?shù)娜〔姆椒?,妊?1~13周時行絨毛膜取樣,妊娠16~22周時行超聲引導下羊膜腔穿刺羊水取樣,妊娠22~37周時行超聲引導下的臍帶穿刺取血(妊娠13~16周時暫不取材)。因此筆者建議,如發(fā)現(xiàn)有耳聾先證者,先確定其耳聾病因;在進行了基因突變分析和詳盡的遺傳咨詢后,再決定其家系成員是否受孕和接受產前診斷。只有這樣,才能真正達到產前診斷目的,從而有效阻斷耳聾在這一高危人群中的傳遞。

        我國每年新生聾兒約3萬例,耳聾的基因篩查和產前診斷依然面臨艱巨的任務和挑戰(zhàn)。隨著新一代測序技術的應用,新的耳聾基因將不斷被發(fā)現(xiàn)和鑒定,這為臨床遺傳性耳聾的基因診斷提供了新的候選位點,也為遺傳咨詢和產前診斷提供了新的依據,有助于進一步降低出生缺陷。

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