呂少溥， 王旭靜， 唐巧玲， 王志興

中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，北京 100081

棉花是世界上的重要經(jīng)濟作物之一，為紡織業(yè)及其相關產(chǎn)業(yè)提供主要原材料。我國是世界上最大的紡織品生產(chǎn)國和消費國，棉花產(chǎn)業(yè)在我國的國民經(jīng)濟中占有舉足輕重的地位［1］?！笆晃濉逼陂g，農(nóng)業(yè)部對我國主產(chǎn)棉省主栽的白色棉花品種纖維的抽查結(jié)果表明：纖維長度主要分布在28～30mm，屬于中絨檔次；纖維整齊度指數(shù)高在83%～85%；斷裂比強度處于中等偏上水平，主要分布在26～28cN／tex和29～31cN／tex；馬克隆值主要分布在4.3～4.9左右，以B1和C2為主，處于A級最佳范圍的樣品則偏少［2］。由于長度在31mm以上、斷裂比強度大于31cN／tex，以及馬克隆值在A級最佳范圍的纖維比較缺乏，導致我國棉花纖維質(zhì)量只能滿足紡織工業(yè)中、低檔棉紗（32～40支紗）的紡織要求，可紡高支紗（60～80支）的原棉纖維所占比例較少［2］。

棉花產(chǎn)量和纖維質(zhì)量呈負相關關系，因此利用常規(guī)育種手段很難同時提高棉花產(chǎn)量和品質(zhì)。隨著生物技術的飛速發(fā)展，基因工程手段已經(jīng)廣泛應用于農(nóng)作物的品種改良中。棉花的分子育種已成為國內(nèi)外棉花研究的重點［3］。克隆與棉花纖維發(fā)育相關的基因及其特異表達啟動子可以實現(xiàn)定向改良棉花纖維品質(zhì)的目的，本文綜述了棉纖維的發(fā)育過程及相關基因與特異性啟動子的研究進展，以期為改良棉花纖維品質(zhì)提供研究參考。

1 棉花纖維的發(fā)育過程

棉纖維是由棉花胚珠外珠被表皮層的單細胞發(fā)育而成，其分化和發(fā)育過程可分為四個時期［4］。

1.1 纖維原始細胞分化期

棉纖維發(fā)育初期，由胚珠表皮細胞分化形成纖維原始細胞，并進一步擴展為球狀或半球狀突起。纖維細胞的分化時間與成熟纖維的長度相關，如果在開花前3d到開花當天分化，則纖維細胞通常形成長纖維（Lint，一般長度為20～30 mm）；而在開花后5～10d分化的細胞則發(fā)育為短絨（Fuzz，一般長度為2～5mm）［5］。

1.2 纖維細胞伸長期

棉纖維細胞的伸長始于開花當天，一般持續(xù)20d左右。在伸長期，纖維細胞中部形成大液泡，液泡膨脹使細胞快速伸長，并伴隨合成纖維細胞的初生壁［6］。伸長期主要影響棉纖維的長度［7］。

1.3 次生壁加厚期

在開花后16～19d，進入纖維細胞次生壁增厚期，一直持續(xù)到開花后40～50d［8］，與伸長期有5～10d的重疊［9］。此期間，細胞合成大量的纖維素沉積在次生壁上，使次生壁不斷增厚。次生壁加厚期與纖維細度、成熟度以及纖維強度相關。

1.4 成熟期

開花后45～60d進入棉纖維細胞成熟期。成熟期間，棉鈴開裂、吐絮，纖維失水、扭曲，最終發(fā)育成熟。成熟期主要影響纖維的扭曲數(shù)［10］。

2 棉花纖維特異基因的研究

雖然對棉花纖維的分子發(fā)育過程已較為清楚，但與棉花纖維發(fā)育相關基因的研究相對滯后。隨著分子生物學的發(fā)展，采用cDNA文庫差示篩選技術、cDNA代表性差異分析技術、抑制差減雜交技術和mRNA差異顯示技術等，現(xiàn)已克隆得到數(shù)十個棉花纖維特異或優(yōu)勢表達的基因（見表1）［11～43］，近年來基因芯片技術、高通量測序技術［44］為棉花纖維特異基因的獲得提供了更為高效的手段。

雖然已經(jīng)克隆得到許多棉纖維特異或優(yōu)勢表達的基因，但是大部分基因多是在煙草或擬南芥中進行驗證，很少一部分是直接在棉花中進行驗證的，所以得到的大部分基因在棉花纖維中的具體作用尚不清楚，只能作為棉纖維品質(zhì)改良的候選基因。在棉纖維中功能研究的比較清楚的有E6、SS3、GaMYB2 等。

2.1 E6 基因

1992年，John等［11］通過cDNA文庫的差示篩選技術發(fā)現(xiàn)了E6基因。它是發(fā)現(xiàn)最早的棉纖維優(yōu)勢表達的基因，主要在棉纖維伸長階段表達，在開花后5～28d都有表達。E6基因具有714bp的開放讀碼框，編碼238個氨基酸。1996年，John等［45］通過35S啟動子連接E6的反義基因轉(zhuǎn)化棉花，發(fā)現(xiàn)E6蛋白表達下降了60%～98%，但是在纖維的發(fā)育中沒發(fā)現(xiàn)明顯的表型變化，對纖維的品質(zhì)沒有影響，說明E6對棉纖維的發(fā)育作用不大，或者棉纖維發(fā)育過程需要的E6蛋白量極低。

2.2 SS3 基因

1997年，Ruan等［22］發(fā)現(xiàn)了編碼蔗糖合成酶的基因SS3，該基因在開花后0～35d表達，決定分配進入纖維細胞的碳素，參與纖維素合成。2003年，Ruan等［46］構(gòu)建了棉花蔗糖合成酶反義基因載體轉(zhuǎn)化棉花，以非轉(zhuǎn)反義基因的棉花為對照，觀察不同時期棉花胚珠，發(fā)現(xiàn)相對于對照組，轉(zhuǎn)基因植株的胚珠大小不變，但是在開花0d的胚珠表面有很少的突起，還伴隨著塌陷與皺縮，開花后3d轉(zhuǎn)基因植株的的棉纖維很短。上述結(jié)果說明，蔗糖合成酶基因在棉纖維起始和伸長中發(fā)揮重要作用。

2.3 GhMYB2 基因

GhMYB2是棉纖維發(fā)育過程中優(yōu)勢表達的一個蛋白。2004年，Wang等［37］通過轉(zhuǎn)化擬南芥，證明GhMYB2基因的第一個內(nèi)含子在擬南芥的表皮毛發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，該基因是表皮毛發(fā)育基因的增強子，而不是表皮毛基因的抑制因子。第一個內(nèi)含子中保守的MYB結(jié)構(gòu)的缺失將影響表皮毛的發(fā)育。2008年，Shangguan等［47］用過量表達和RNA干擾的方式構(gòu)建了植物表達載體轉(zhuǎn)化棉花，發(fā)現(xiàn)降低實驗組陸地棉GhMYB2基因的表達會導致開花當天纖維分化突起數(shù)量相對于對照組明顯減少，而且3-DPA的纖維伸長明顯短于對照組，最終成熟后實驗組的成熟纖維也比對照組短。棉花種子的發(fā)育也受到GhMYB2基因表達的較大影響，相對于對照組，降低GhMYB2基因表達的棉花種子變小，成熟率降低；而過量表達GhMYB2基因的實驗組其成熟棉纖維變長，種子也變大。另外，無論是降

低GhMYB2基因的表達還是過量表達GhMYB2基因都能在轉(zhuǎn)基因棉花后代中穩(wěn)定的遺傳。所以Shangguan等認為GhMYB2基因是對棉花纖維的伸長有重要調(diào)控作用，而且還會影響種子的發(fā)育。

表1 已克隆的棉花纖維特異表達基因 Table 1 Cotton fiber specific gene.

3 棉花纖維特異表達啟動子的研究

早期，研究人員多用組成型啟動子表達棉纖維特異基因，以研究基因功能。而隨著研究的進一步發(fā)展，發(fā)現(xiàn)組成型啟動子具有一定的缺陷，即組成型啟動子可以驅(qū)動目的基因在各個時期都表達，不僅會消耗棉花體內(nèi)大量能量物質(zhì)，而且會影響了植物的生長發(fā)育［48］。為了解決這個問題，研究人員采用染色體步移等技術克隆了棉纖維的特異啟動子，目前已經(jīng)克隆得到數(shù)十個棉花纖維優(yōu)勢表達的啟動子（表2）［11，14，19，30，37，49～61］。

表2 棉花纖維優(yōu)勢啟動子 Table 2 Cotton fiber advantage promoter.

克隆得到的棉纖維啟動子由于具有應用前景，大多已經(jīng)申請專利，有一部分已應用到棉花纖維改良中。1996年，John等［61］用E6啟動子和FbL2A啟動子分別連接乙酰CoA還原酶基因和PHB合酶基因，導入棉花提高了棉花纖維的熱絕緣性能；2002年，李文彬等［62］利用LTP12啟動子連接表達靛藍色素BCE基因和表達紅色花色素合成酶DFR基因，轉(zhuǎn)化棉花后獲得了靛藍色和和紅色的棉纖維；2004年，張震林等［63］將E6啟動子連接兔角蛋白基因轉(zhuǎn)入棉花，改良了棉花纖維的強度，與對照相比，平均提高了6.3cN／tex；2007年，Xu等［64］用LTP3啟動子連接TYRA和ORF38黑色素合成酶基因并導入棉花，獲得了褐色表型的棉纖維；2010年，孟亞雄等［65］將LTP12棉纖維特異啟動子連接表達PHB合成酶的基因?qū)朊藁ǎ牧剂嗣蘩w維的保暖性和抗皺性。

4 展望

隨著分子生物學技術日新月異的發(fā)展，特別是高通量技術的出現(xiàn)，為特異基因的克隆提供了極大的便利；隨著染色體步移技術的改進，對特異基因上游啟動子的查找提供了越來越多的辦法，這些都為用基因工程方法改進棉纖維品質(zhì)提供了參考方案。但是，棉纖維的發(fā)育過程是一個復雜的多基因參與的過程，基因工程改良棉纖維品質(zhì)的研究存在很大的難度。第一，增加或者刪除某一個基因并不一定能對棉纖維品質(zhì)的改變造成重大影響，如反義表達E6基因，E6蛋白表達下降了60%～98%，但對纖維發(fā)育沒有明顯影響；第二，棉花基因工程研究中，棉花的轉(zhuǎn)化效率很低，目前棉花轉(zhuǎn)化多采用農(nóng)桿菌介導法，由于種植棉多為異源四倍體植株，農(nóng)桿菌所攜帶的目的基因隨機整合，其轉(zhuǎn)化效率很低?？寺∶蘩w維特異基因及其啟動子為棉纖維品質(zhì)的改良確定了一條路徑，隨著生物技術的發(fā)展以及對棉花發(fā)育的深入研究，分子育種和常規(guī)育種結(jié)合將成為以后改良棉花纖維品質(zhì)的趨勢。

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