天津市寶坻區(qū)藥品檢驗(yàn)所（301800）劉志會

四環(huán)素類抗生素系以具有共同多環(huán)并四苯酸基酰胺母核的衍生物，是一種廣譜抗菌素，臨床上主要用于革蘭陽性菌、陰性菌感染，以及立克次體病、衣原體病、支原體病、螺旋體病的治療。目前，四環(huán)素片的含量測定方法為中國藥典規(guī)定的抗生素微生物檢定法，收載于衛(wèi)生部《藥品標(biāo)準(zhǔn)·抗生素分冊(第一冊)》。該方法檢驗(yàn)周期長，操作繁瑣，影響因素多，易造成誤差。且不能滿足批量生產(chǎn)質(zhì)量控制的需要。因此，筆者采用高效液相色譜法代替效價(jià)法測定四環(huán)素片的含量，該方法檢驗(yàn)周期短、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性好，現(xiàn)介紹如下。

1 儀器與試藥

1.1 日本島津產(chǎn)UV-2401PC紫外分光光度計(jì)；日本島津產(chǎn)LC-2010CHT高效液相色譜儀；梅特勒AG-135型電子天平；梅特勒TOLEDO型酸度計(jì)(精度：0.01 pH單位)；KQ-5200E型超聲波清洗器；醋酸銨、乙二胺四醋酸二鈉、三乙胺、醋酸、鹽酸均為分析純。一次性微孔濾膜(孔徑0.45μm)。

1.2 四環(huán)素對照品(批號：130488-200103含量：97.5% 中國藥品生物制品檢定所) 四環(huán)素片3批：A藥廠生產(chǎn)(批號：130904，規(guī)格：0.25 g)，B藥廠生產(chǎn)(批號：131007，規(guī)格：0.25 g)，C藥廠生產(chǎn)(批號：130313，規(guī)格：0.25 g)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱 phenomenexTM-C18(4.6 mm×250 mm，5μm)色譜柱；流動相 醋酸銨溶液【0.15mol/l醋酸銨溶液-0.01mol/l乙二胺四醋酸二鈉溶液-三乙胺(100∶10∶1),用醋酸調(diào)節(jié)pH值至8.5】-乙腈（83∶17）；流速：1.0/min；柱溫：30℃；檢測波長：280nm；進(jìn)樣量：10μl。理論塔板數(shù)按四環(huán)素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000，四環(huán)素峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合中國藥典2010年版二部附錄VD規(guī)定(應(yīng)不低于1.5)。

2.2 溶液的制備 精密稱定鹽酸四環(huán)素對照品26.29mg，置于50ml容量瓶中，用0.01mol／L鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5ml，置于25ml容量瓶中，用0.01 mol／L鹽酸溶液稀至刻度，搖勻,即得對照品溶液。取四環(huán)素片10片，精密稱定，平均片重0.5408g,研細(xì)，精密稱取0.5394g(約相當(dāng)于四環(huán)素0.25g)，置于250ml容量瓶中，用0.01mol／L鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液5ml，置于50ml容量瓶中，用0.01 mol／L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

附圖

附表 回收率測定結(jié)果

2.3 色譜測定 分別精密量取對照品溶液（0.1mg/ml）和供試品溶液（0.1m g/ml）各10μl ，注入液相色譜儀（自動進(jìn)樣）測定即得。見附圖。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密量取鹽酸四環(huán)素對照品溶液 （0.1mg/ml）10ul，注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，6次進(jìn)樣鹽酸四環(huán)素峰面積分別為：1969243、1906511、1973703、1970883、1905326、1945634,平均為1945216，RSD為1.6%。

2.4.2 線性關(guān)系考察 取上述鹽酸四環(huán)素對照品溶液(0.1mg/ml )，分別精取 1、3、5、10、20、40、60μl，注入液相色譜儀(自動進(jìn)樣)，記錄色譜圖。得各峰面積分別為190574、530381、888196、1893418、3781926、7509729、11204253，以進(jìn)樣量對峰面積進(jìn)行回歸，得回歸方程：Y=187298X-5131.5，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號樣品(批號：130904)，分別于0、3、5、7、10、12測定，供試品中四環(huán)素峰面積分別為：1901692、1880389、1878453、1850824、1835140、1805278，結(jié)果RSD為1.9% 。結(jié)果表明，樣品在12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批號樣品(批號：130904)，依供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，分別測定峰面積，計(jì)算四環(huán)素含量。結(jié)果測得平均含量為97.53%，RSD為0.47%(n=6)，試驗(yàn)結(jié)果表明該法重現(xiàn)性良好。

2.4.5 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量(451mg/g)的樣品6份，配置成所需濃度，和標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.5258mg/ml )，各5mL，置于50mL量瓶中，加0.01 mol/l鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液各10ul 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算回收率，結(jié)果見附表。

2.4.6 樣品含量的測定 取三批樣品，依法制備供試品溶液，精密吸取10ul ，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果批號為：A藥廠生產(chǎn)（批號：130904，規(guī)格：0.25 g) ： B藥廠生產(chǎn)(批號：131007 ，規(guī)格：0.25 g)： C藥廠生產(chǎn)(批號：130313，規(guī)格：0.25g)的樣品中四環(huán)素含量分別為97.7% 、91.8% 、96.4% 。

3 討論

由于四環(huán)素是用生物發(fā)酵工藝制備的，含有一些雜質(zhì) ，在實(shí)驗(yàn)過程中如果遇到四環(huán)素主峰與相鄰雜質(zhì)峰分離效果不能滿足實(shí)驗(yàn)要求時(shí)，可以減少乙腈的比例，改變流動相的極性，使四環(huán)素主峰的保留時(shí)間延長，達(dá)到其與雜質(zhì)峰分離的目的。具體改變多少，依據(jù)實(shí)驗(yàn)條件反復(fù)摸索而定。如果流動相的pH值大于8，應(yīng)采用耐堿的色譜柱，否則,會使鏈端的結(jié)構(gòu)被“置換”或改變，從而加速硅膠的溶解而釋放出絮狀物堵塞柱子，長時(shí)間使用會造成色譜柱柱效降低。