韓銀淑

[摘要] 目的 本文通過研究染料木素（Gen）對體外培養(yǎng)MGC-803細胞增殖以及PKA活性的影響，探討Gen抑制MGC-803細胞系增殖的分子機制。方法 光鏡下觀察經Gen處理后人胃癌MGC-803細胞形態(tài)學改變；應用MTT法檢測Gen對體外培養(yǎng)的人胃癌MGC-803細胞增殖影響；PepTag法檢測Gen對MGC-803細胞PKA活性的調節(jié)。結果 與空白對照組比較，經Gen處理后MGC-803細胞外形呈不規(guī)則狀、細胞間隙增大、折光性差；MTT實驗發(fā)現(xiàn)Gen能夠抑制體外培養(yǎng)的MGC-803細胞增殖，并且抑制作用呈現(xiàn)時間及濃度依賴性；濃度為40 μg/mL的 Gen可以顯著上調MGC-803細胞的PKA活性（P<0.01）。結論 Gen對人胃癌細胞系MGC-803細胞的增殖有抑制作用，上調PKA活性可能是Gen抑制人胃癌MGC-803細胞增殖的機制之一。

[關鍵詞] 染料木素；MGC-803細胞；PKA活性

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）28-0001-03

染料木素（Genistein，Gen）是一種來源于大豆或其他豆科植物的大豆異黃酮，其具有類雌激素、抗氧化、調節(jié)血脂等生物活性。流行病學研究和實驗研究證實Gen能降低乳腺癌[1]、前列腺癌[2]等激素依賴型腫瘤的發(fā)生率，對激素依賴型腫瘤的預防和治療有一定的療效。此外，Gen對消化道腫瘤也有明顯的抑制作用，然而其抗腫瘤作用機制尚不清楚[3]。本文通過研究Gen對人胃癌細胞MGC-803增殖及PKA活性的影響，探討Gen抑制MGC-803細胞系增殖的分子機制，為Gen在臨床上的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細胞系

人胃黏液性腺癌細胞株MGC-803由齊齊哈爾醫(yī)學院中心實驗室贈予。培養(yǎng)基選用RPMI-1640完全培養(yǎng)液，加10%滅活hyclon胎牛血清、100 IU/mL鏈霉素和100 IU/mL青霉素。收集MGC-803細胞，稀釋至1×105/mL，接種于培養(yǎng)皿，37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。當MGC-803細胞生長覆蓋了80%培養(yǎng)皿表面積時要傳代，實驗時取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞。

1.2 藥物與試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基為Invitrogen產品；胎牛血清為Hyclon產品；Aprotinine、PMSF、DTT、EGTA為Sigma-Aldrich產品；PKA活性檢測試劑盒為Promega產品。Gen為陜西天行健生物化學技術有限公司產品，用1 mL MSO溶解配成濃度為40 mg/mL原液，4℃冰箱保存。實驗時用培養(yǎng)液將Gen溶液稀釋到所需要的濃度。

1.3主要實驗儀器

Milli-Q超純水系統(tǒng)為MILLIPORE產品；CO2培養(yǎng)箱為NuAire生產；電泳槽為BIO-RAD；CKX31型倒置顯微鏡為日本Olympus；IF-90紫外透射儀為上海顧林電光儀器廠生產。

1.4 實驗方法

1.4.1 Gen對MGC-803細胞增殖的影響 實驗設空白組（完全培養(yǎng)基）、空白對照組和Gen處理組。將對數(shù)生長期MGC-803細胞收集、離心并去除上清液，稀釋MGC-803細胞至5×104個/mL。按每孔200 μL將MGC-803細胞接種于3塊96孔培養(yǎng)板，37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。然后棄除培養(yǎng)液，Gen處理組分別加入用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋的不同濃度Gen溶液200 μL/孔（Gen濃度分別為2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL）， 空白對照組則加RPMI-1640培養(yǎng)液200 μL/孔，空白對照組和Gen處理組均設3個平行孔。在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，各組均在實驗終止前4 h時加5 mg/mL濃度的MTT 20 μL/孔，并于4 h后棄除上清液，每孔再加DMSO 150 μL。以空白組（完全培養(yǎng)基）將酶標儀調零，570 nm波長下測定OD值，計算Gen對GMC-803細胞增殖的抑制率。細胞增殖抑制率=（1-Gen處理組平均OD值/空白對照組平均OD值）×100%，實驗結果重復3次。

1.4.2 Gen對MGC-803細胞形態(tài)學影響 實驗設空白對照組和Gen處理組。上述兩組均培養(yǎng)24 h后移除培養(yǎng)液，空白對照組加200 μL/孔的RPMI-1640培養(yǎng)液，Gen處理組每孔加40 μg/mL Gen溶液200 μL，各組均設平行孔3個。37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h后，光鏡下觀察經Gen處理后MGC-803細胞形態(tài)學的改變。

1.4.3 Gen對MGC-803細胞PKA活性的調節(jié) 收集對數(shù)生長期的MGC-803細胞，稀釋至5×104個/mL，接種于培養(yǎng)皿，并隨機分為空白對照組、40 μg/mL Gen處理組?？瞻讓φ战M加200 μL/孔的RPMI-1640培養(yǎng)液，40 μg/mL Gen處理組每孔加40 μg/mL Gen溶液200 μL，各組均設平行孔3個，37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h。按試劑盒說明分別進行樣品提取、考馬斯亮藍法測定蛋白、分離磷酸化和非磷酸化的PepTag短肽、熒光光度計定量分析檢測PepTag結果及計算各組的PKA活性。

1.5 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)用SPSS13.0進行統(tǒng)計學處理，所有數(shù)據(jù)經正態(tài)性檢驗均服從正態(tài)分布。統(tǒng)計描述以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析比較多組間均數(shù)，進一步的兩兩比較則分別采用SNK法和Dunnet-t檢驗。兩組間采用配對t檢驗，P<0.05差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Gen對MGC-803細胞增殖的影響

MTT實驗發(fā)現(xiàn)Gen對體外培養(yǎng)的MGC-803細胞增殖有抑制作用，且抑制作用呈時間及濃度依賴性。用Gen處理24 h后，10 μg/mL Gen組、20 μg/mL Gen組、40 μg/mL Gen組與空白對照組比較，對MGC-803細胞的抑制作用顯著（P<0.01）；Gen處理48h后，5 μg/mL組、10 μg/mL組、20 μg/mL組、40 μg/mL組對MGC-803細胞的抑制作用顯著（P<0.01）；而處理72 h后，所有Gen處理組均對MGC-803細胞有顯著抑制作用（P<0.01）。Gen處理48 h和72 h與24 h比較，Gen濃度為10 μg/mL組、20 μg/mL組、40 μg/mL組與空白對照組比較有抑制作用（P<0.05），而對于2.5 μg/mL組，僅處理72 h時有抑制作用（P<0.05）。Gen處理72 h與48 h相比較，Gen濃度為10 μg/mL組、20 μg/mL組、40 μg/mL組抑制作用有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在Gen濃度為40 μg/mL時，處理72 h后對MGC-803抑制率達72.3%，見表1。

2.2 Gen對MGC-803細胞形態(tài)的影響

光鏡下可見空白對照組MGC-803細胞生長狀態(tài)良好，貼壁生長旺盛。細胞外形輪廓清晰、細胞間結構緊密、大小均勻，呈現(xiàn)多邊形或梭形，且細胞質的折光性較強。而經過Gen處理后，發(fā)現(xiàn)MGC-803細胞生長狀態(tài)較差，細胞外形呈現(xiàn)圓形或不規(guī)則狀、細胞間隙明顯增大，且細胞質折光性較差，見圖1 。

2.3 Gen對MGC-803細胞PKA活性的調節(jié)

采用濃度為40 μg/mL的Gen處理MGC-803細胞，培養(yǎng)48h后檢測PKA活性。實驗結果顯示，空白對照組PKA活性為（0.571±0.053） U/mL，而Gen處理組PKA的活性為（0.97±0.09） U/mL，兩組間差異顯著，有統(tǒng)計學意義（P<0.01），如圖2。

3 討論

Gen是一種來源于大豆以及其他豆科植物中的大豆異黃酮，其具有雌激素、抗氧化、調血脂等功能。流行病學調查表明，在經常食用豆制品的日本乳腺癌發(fā)病率僅為美國的1/4[4]，Gen可以降低乳腺癌[1]、前列腺癌[2]等激素依賴型腫瘤的發(fā)生率。有研究[3，5]亦發(fā)現(xiàn)，Gen可以抑制子宮內膜腺癌細胞（JEC）、人肝癌SMMC-7721、人胃癌SGC-7901細胞的增殖有明顯的抑制作用，然而Gen抗腫瘤作用分子機制尚不十分清楚[3]。本文研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比較，光鏡下經Gen處理的MGC-803細胞折光性差，細胞間隙增大，提示Gen對體外培養(yǎng)的MGC-803細胞具有細胞毒作用；而MTT實驗結果驗證Gen可以顯著地抑制MGC-803細胞增殖，并隨著作用時間和濃度的增加而增強，呈時間及濃度依賴性。

cAMP-PKA信號通路介導一系列的神經遞質、激素等胞外信號進入細胞內，激活此通路可抑制細胞增殖，誘導分化[4-10]。PKA通過磷酸化激活下游轉錄因子，調節(jié)靶基因的轉錄。如PKA可催化CREB（cAMP-responsive element binding Protein，CREB）、CREM（cAMP-responsive element binding modulator，CREM）及ATF1（activating transcription factor 1，ATF1）磷酸化，被激活的轉錄因子與CBP（CREB binding protein）和p300結合調控下游靶基因[8，11]。實驗研究已發(fā)現(xiàn)Gen可以激活SHZ-88大鼠乳腺癌細胞內cAMP-PKA信號通路，經濃度為15μg/mL的Gen處理5min和10min后，腫瘤細胞內cAMP濃度升高了11.0%和40.3%[9]。本文研究顯示，濃度為40μg/mL的Gen作用MGC-803細胞48h后，可以顯著提高MGC-803細胞的PKA活性。實驗結果提示Gen亦可以不經過第二信使cAMP而直接激活PKA，進而抑制體外培養(yǎng)的MGC-803細胞增殖。綜上所述，Gen能夠抑制體外培養(yǎng)的人胃癌MGC-803細胞系的增殖，上調PKA活性可能是Gen抑制MGC-803細胞增殖機制之一。

[參考文獻]

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（收稿日期：2014-05-05）