劉 毅，馮曉桃，2*，王文健，汪天湛，陳 熤，陳偉華

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，上海 200040;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧 530001)

骨骼肌組織是胰島素最大的靶組織，在胰島素介導(dǎo)的葡萄糖利用方面起著重要的作用［1］。胰島素誘導(dǎo)骨骼肌葡萄糖利用功能下降，可以導(dǎo)致骨骼肌器官特異性胰島素抵抗。前期研究顯示活血化瘀中藥蒲黃提取物——蒲黃總黃酮能提高高糖高胰島素所致胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗和葡萄糖攝取，顯示蒲黃總黃酮具有改善胰島素抵抗的潛在效應(yīng)［2］。本研究旨在通過觀察蒲黃總黃酮對C2C12骨骼肌細(xì)胞葡萄糖消耗及Src蛋白表達(dá)的影響，探討蒲黃總黃酮改善胰島素抵抗?jié)撛跈C(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)培養(yǎng)基、胎牛血清和馬血清來自Gibco公司;牛血清白蛋白 (bovine serum albumin，BSA)和胰島素購自Sigma公司;抗β-arrestin-2和抗Src抗體購自Santa Cruz公司;抗p-Src(Tyr416)抗體由Calbiochem公司提供;抗p-Akt(Ser473)抗體購自Cell Signaling公司;蒲黃總黃酮由上海信誼藥業(yè)有限公司提供，純度為85%。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分化 C2C12骨骼肌細(xì)胞株購自美國菌種保藏中心，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至接觸抑制時，將培養(yǎng)液換成含2%馬血清DMEM誘導(dǎo)細(xì)胞分化，誘導(dǎo)分化4 d，95%以上細(xì)胞出現(xiàn)肌管可用于實驗［3］。培養(yǎng)液每2 d換1次。

1.3 葡萄糖消耗分析 將96孔板中分化成熟的細(xì)胞用含1%BSA低糖 DMEM孵育12 h，然后換上含胰島素(10 nmol/L)及不同終質(zhì)量濃度蒲黃總黃酮 (0、0.1、0.25、0.5 g/L)的含1%BSA的DMEM培養(yǎng)基孵育。分別培養(yǎng)8、16、24 h后，葡萄糖氧化酶法檢測每孔培養(yǎng)基葡萄糖量。用不含細(xì)胞的培養(yǎng)孔內(nèi)培養(yǎng)基葡萄糖量均值減去各組培養(yǎng)孔培養(yǎng)基中剩余的葡萄糖量，即為每孔細(xì)胞葡萄糖消耗量。

1.4 免疫印跡和免疫共沉淀分析 細(xì)胞分化成熟后以1%BSA低糖DMEM孵育12 h，然后分為對照組和蒲黃總黃酮組，予含或不含0.5 g/L蒲黃總黃酮培養(yǎng)液孵育16 h，接著予或不予胰島素 (100 nmol/L)刺激30 min。收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度。樣品與抗β-arrestin-2抗體孵育，沉淀物目標(biāo)蛋白用免疫印跡法鑒定。取等量蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉，一抗、二抗孵育?；瘜W(xué)發(fā)光法顯影曝光，凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)蛋白印跡條帶。

2 結(jié)果

2.1 蒲黃總黃酮對C2C12骨骼肌細(xì)胞葡萄糖消耗的影響如圖1所示，與對照組比較，胰島素在8、16、24 h 3個時間點(diǎn)上都能顯著提高C2C12骨骼肌細(xì)胞葡萄糖消耗。而與胰島素組相比較，蒲黃總黃酮干預(yù)8 h，只有蒲黃總黃酮0.5 g/L+胰島素組能顯著提高細(xì)胞的葡萄糖消耗 (P＜0.05);干預(yù)16 h，蒲黃總黃酮0.25 g/L+胰島素組和蒲黃總黃酮0.5 g/L+胰島素組均能顯著提高細(xì)胞的葡萄糖消耗(P＜0.05或P＜0.01);而干預(yù)24 h，3個質(zhì)量濃度 (0.1、0.25、0.5 g/L)蒲黃總黃酮+胰島素組都能明顯提高細(xì)胞的葡萄糖消耗 (P＜0.05或P＜0.01)。提示蒲黃總黃酮呈時間和質(zhì)量濃度依賴性提高C2C12骨骼肌細(xì)胞葡萄糖消耗。

2.2 蒲黃總黃酮對Src蛋白表達(dá)的影響 如圖2所示，在基礎(chǔ)狀態(tài)下，蒲黃總黃酮干預(yù)C2C12骨骼肌細(xì)胞16 h能提高Src蛋白表達(dá)，是對照組的1.72倍，差異顯著 (P＜0.01);而蒲黃總黃酮干預(yù)細(xì)胞16 h后，再予胰島素刺激30 min，蒲黃總黃酮也能提高Src蛋白表達(dá)，是胰島素組的1.67倍，差異明顯 (P＜0.01)。

圖1 蒲黃總黃酮對C2C12骨骼肌細(xì)胞葡萄糖消耗的影響

2.3 蒲黃總黃酮對p-Src蛋白表達(dá)的影響 如圖2顯示，在無胰島素刺激狀態(tài)下，蒲黃總黃酮干預(yù)C2C12骨骼肌細(xì)胞16 h對Src磷酸化水平無顯著影響 (P＞0.05);而蒲黃總黃酮干預(yù)細(xì)胞16 h后，再予胰島素刺激30 min，蒲黃總黃酮能提高Src磷酸化水平，是胰島素組的1.54倍，差異顯著 (P＜0.01)。

圖2 蒲黃總黃酮對C2C12骨骼肌細(xì)胞Src蛋白表達(dá)及其磷酸化水平的影響

2.4 蒲黃總黃酮對Src相關(guān)信號復(fù)合物的影響 實驗以βarrestin-2抗體為一抗，采用免疫共沉淀法檢測Src相關(guān)信號復(fù)合物，并用免疫印跡法鑒定其中的目標(biāo)蛋白。如圖3所見，在無胰島素刺激狀態(tài)下，Src相關(guān)信號復(fù)合物形成很少，蒲黃總黃酮干預(yù)16 h也無明顯促進(jìn)作用。但胰島素刺激30 min能顯著促進(jìn)Src相關(guān)信號復(fù)合物形成，與此相比較，蒲黃總黃酮干預(yù)16 h，再予胰島素刺激30 min，蒲黃總黃酮能顯著提高Src相關(guān)信號復(fù)合物形成，而且Src(Tyr416)磷酸化水平及其下游Akt(Ser473)磷酸化水平都顯著提高。

3 討論

圖3 蒲黃總黃酮對C2C12骨骼肌細(xì)胞Src相關(guān)信號復(fù)合物的影響

蒲黃性平味甘，入肝經(jīng)和心包經(jīng)，具有活血化瘀、止血、通淋等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實蒲黃具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和免疫應(yīng)答，降低血小板聚集、促進(jìn)纖溶、抗血栓和促凝血雙向調(diào)節(jié)作用［4］。近年來，蒲黃已廣泛用于臨床治療2型糖尿病、代謝綜合征、非酒精性脂肪肝等以胰島素抵抗為病理生理學(xué)基礎(chǔ)的疾病，但其機(jī)制尚未完全清楚。本研究表明，蒲黃總黃酮能提高C2C12骨骼肌細(xì)胞葡萄糖消耗，從而促進(jìn)細(xì)胞葡萄糖利用，這與先前的報道相一致［2］，表明蒲黃總黃酮具有改善胰島素抵抗的作用。

Src是一種酪氨酸激酶，能夠通過其SH3結(jié)構(gòu)域直接作用于Akt，并且這種相互作用是Akt磷酸化活化的基礎(chǔ)［5］。Src活性主要由其酪氨酸磷酸化位點(diǎn)所調(diào)控，其中激酶區(qū)Tyr416磷酸化能上調(diào)Src活性［6］。最近研究表明，依賴于胰島素刺激，Src借助β-arrestin-2蛋白橋接作用與其上游胰島素受體 (InsR)和下游Akt形成信號復(fù)合物，刺激信號由InsR傳遞到Src并使其Tyr416磷酸化而被活化，隨后 Src磷酸化 Akt，進(jìn)而促使 Akt自身 Thr308和Ser473磷酸化，從而促進(jìn)細(xì)胞葡萄糖消耗和利用［7-8］。使用Src特異性阻斷劑PP2可抑制Src活性，導(dǎo)致發(fā)生胰島素抵抗，抑制細(xì)胞葡萄糖利用［8-9］。眾所周知，游離脂肪酸Palmitate可以引起胰島素抵抗，其中關(guān)鍵機(jī)制之一就是在胰島素刺激下Src酪氨酸磷酸化水平受限［9-10］。在實驗研究中發(fā)現(xiàn)，蒲黃總黃酮不僅能夠提高骨骼肌細(xì)胞Src蛋白表達(dá)量，而且還能提高其Tyr416磷酸化水平。項目組曾報道過［11］，蒲黃總黃酮能夠改善Palmitate抑制骨骼肌細(xì)胞葡萄糖消耗和攝取，提高細(xì)胞的胰島素敏感性。據(jù)此，可以推測蒲黃總黃酮提高C2C12骨骼肌細(xì)胞葡萄糖消耗很有可能與Src蛋白表達(dá)上調(diào)及其信號復(fù)合物形成有密切的關(guān)系。為了證明這一點(diǎn)，項目組采用免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)行實驗，發(fā)現(xiàn)蒲黃總黃酮能促進(jìn)Src相關(guān)信號復(fù)合物形成，而且在該復(fù)合物中，Src(Tyr416)磷酸化水平顯著提高，進(jìn)而引起Akt(Ser473)明顯磷酸化。曾報道蒲黃總黃酮能提高β-arrestin-2蛋白表達(dá)，而這也有利于Src相關(guān)信號復(fù)合物的形成［8，12］，與本研究結(jié)果相一致。

因此，蒲黃總黃酮能提高C2C12骨骼肌細(xì)胞Src蛋白表達(dá)及其磷酸化水平，進(jìn)而促進(jìn)其信號復(fù)合物形成，這可能是蒲黃總黃酮改善胰島素抵抗的機(jī)制之一。

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