段賢春，陳 曦，2，汪永忠*，高家榮，朱 紅，韓燕全，李 穎，方朝暉，夏倫祝

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230038;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230031)

蓯歸益腎膠囊是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院多年臨床使用的經(jīng)驗(yàn)方，由肉蓯蓉、當(dāng)歸、山茱萸等組成，具有溫陽固腎、養(yǎng)陰益氣、活血利水之功效，主要用于陰陽兩虛型糖尿病腎病。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［1-2］發(fā)現(xiàn)，其對(duì)2型糖尿病大鼠腎小球、腎小管具有顯著的保護(hù)作用，抑制腎小球增大，減少病變腎小球數(shù);并能改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗，保護(hù)胰島細(xì)胞。前期臨床研究顯示［3-4］，蓯歸益腎膠囊可以降低糖尿病腎病患者血漿內(nèi)皮素和改善血小板功能，繼而改善臨床癥狀，對(duì)早期糖尿病腎病有較好的治療用。本實(shí)驗(yàn)采用L9(34)正交設(shè)計(jì)，以君藥肉蓯蓉中所含的松果菊苷、毛蕊花糖苷2種成分總含有量、臣藥山茱萸中馬錢苷含有量以及浸膏得率為指標(biāo)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇倍數(shù)、提取次數(shù)、提取時(shí)間為考察因素，優(yōu)選提取工藝，以便更好地應(yīng)用于臨床。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters UPLC超高效液相色譜儀 (美國Waters公司);KDM型恒溫電熱套 (山東省鄄城光明儀器有限公司);HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限工司);KQ3200DB型超聲儀 (昆山市超聲儀器有限公司);BP211D十萬分之一電子分析天平 (德國賽多利斯)。

1.2 試藥 松果菊苷對(duì)照品 (中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)111670-200503);毛蕊花糖苷對(duì)照品 (中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)11530-201208);馬錢苷對(duì)照品 (中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)111640-201005)，乙腈、甲醇 (色譜純，美國Tedia公司);屈臣氏蒸餾水;其余試劑均為分析純。藥材由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)鑒定為《中國藥典》2010年版一部所收載品種。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交工藝設(shè)計(jì)［5］采用L9(34)正交方案。根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取影響醇提效果的主要因素:乙醇體積分?jǐn)?shù) (A)、乙醇用量 (B)、提取時(shí)間 (C)、提取次數(shù) (D)作為考察因素，試驗(yàn)因素水平見表1。按處方比例稱取藥材，按正交實(shí)驗(yàn)表安排實(shí)驗(yàn)。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

2.2 UPLC雙通道法測(cè)定干膏中松果菊苷、毛蕊花糖苷、馬錢苷的量

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Acquity UPLC BEH C18柱 (100 mm×2.1 mm，1.7 μm);乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸為流動(dòng)相B;體積流量0.25 mL/min;柱溫30℃;檢測(cè)波長330 nm(檢測(cè)松果菊苷、毛蕊花糖苷)，240 nm(檢測(cè)馬錢苷);進(jìn)樣量1 μL，梯度洗脫程序見表2。在此色譜條件下，松果菊苷、毛蕊花糖苷、馬錢苷與其他成分可達(dá)基線分離。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution manner

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取松果菊苷對(duì)照品2.05 mg、毛蕊花糖苷對(duì)照品2.10 mg，分別用50%甲醇定容至10 mL，搖勻，配制成對(duì)照品貯備液［6］。精密移取松果菊苷對(duì)照品貯備液2.5 mL，毛蕊花糖苷對(duì)照品貯備液1.25 mL置5 mL棕色量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻制成含松果菊苷 0.1025 mg/mL、含毛蕊花糖苷 0.0525 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

精密稱取馬錢苷2.17 mg，用80%甲醇定容至10 mL，搖勻，配制成對(duì)照品貯備液，精密移取馬錢苷對(duì)照品貯備液2.5 mL，置5 mL棕色量瓶中，加80%甲醇定容至刻度，搖勻制成含馬錢苷0.1085 mg/mL 對(duì)照品溶液［6］。

2.2.3 供試品溶液的制備 取1～9號(hào)浸膏細(xì)粉各0.5 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，稱定質(zhì)量，超聲處理 (150 W，40 Hz)30 min，放冷，再用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液制備 按照處方和工藝制備肉蓯蓉陰性制劑、山茱萸陰性制劑，再按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

（3）采用變分基本原理，對(duì)采用變分方法如何確定橋梁結(jié)構(gòu)在某特定條件下溫度的具體分布進(jìn)行了分析，并闡述對(duì)溫度場(chǎng)分布實(shí)施有效簡化的具體方法。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別自動(dòng)進(jìn)樣毛蕊花糖苷松果菊苷混合對(duì)照品溶液 0.5、1、2、3、4、5 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以進(jìn)樣量(X)對(duì)色譜峰峰面積 (Y)進(jìn)行線性回歸，得松果菊苷回歸方程:y=2320526.40x－27943.55(r=0.99999，n=6)，結(jié)果表明松果菊苷進(jìn)樣在51.3～513 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系;得毛蕊花糖苷回歸方程 y=1227597.37x－2655.52(r=0.99999，n=6)，表明毛蕊花糖在進(jìn)樣質(zhì)量濃度為26.3～263 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

分別自動(dòng)進(jìn)樣質(zhì)量濃度為0.1086 mg/mL的馬錢苷對(duì)照品溶液 0.5、1、2、3、4、5 μL，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，以進(jìn)樣量 (X)對(duì)色譜峰峰面積 (Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:y=3026418.27x－1180.81(r=0.99998，n=6)。結(jié)果表明馬錢苷在54.3～543 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.2.6 專屬性試驗(yàn) 分別自動(dòng)進(jìn)樣各對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各1 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。從圖中可以看出，供試品色譜在與對(duì)照品色譜相同保留時(shí)間相應(yīng)的位置上有色譜峰，陰性對(duì)照品在與對(duì)照品相同的相同保留時(shí)間相應(yīng)的位置上無色譜峰。說明供試品中其他組分對(duì)測(cè)定結(jié)果無影響，陰性無干擾，色譜圖見圖1、圖2。

圖1 混合對(duì)照品 (A)、樣品 (B)、缺肉蓯蓉陰性樣品(C)圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)，sample(B)，sample without Cistanches Herba(C)

圖2 馬錢苷對(duì)照品 (A)、樣品 (B)、缺馬錢苷陰性樣品 (C)圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of loganin(A)，sample(B)，sample without Corni Fructus(C)

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取松果菊苷毛蕊花糖苷總混合對(duì)照品溶液，自動(dòng)連續(xù)進(jìn)樣6次，每次1 μL，記錄峰面積，松果菊苷、毛蕊花糖苷的RSD值分別為1.09%、1.85%;取馬錢苷對(duì)照品溶液，自動(dòng)連續(xù)進(jìn)樣6次，每次1 μL，記錄峰面積，RSD為1.87%，RSD值均小于2%，表明儀器的精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取7號(hào)浸膏粉末6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，自動(dòng)進(jìn)樣1 μL，按色譜條件測(cè)定松果菊苷和毛蕊花糖苷峰面積，結(jié)果松果菊苷、毛蕊花糖苷、馬錢苷平均含有量分別為3.104、1.064、3.031 mg/g，RSD分別為 1.25%、1.97%、0.82%，RSD值均小于2%，表明本方法重復(fù)性良好。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)Tab.3 Results of recovery tests(n=9)

2.2.10 供試品中松果菊苷、毛蕊花糖苷、馬錢苷的測(cè)定 分別自動(dòng)進(jìn)樣各號(hào)供試品溶液1 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果見表4。

2.3 浸膏得率的計(jì)算 將所得各組提取液均濃縮至200 mL，分別取50 mL于蒸發(fā)皿中，70℃水浴濃縮至稠浸膏，再轉(zhuǎn)移至烘箱中70℃真空干燥至恒定質(zhì)量，干燥器中冷卻，迅速稱定質(zhì)量，計(jì)算干膏得率，結(jié)果見表4。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of orthogonal design

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析 計(jì)算每組樣品中松果菊苷和毛蕊花糖苷總含有量、馬錢苷含有量、浸膏得率，并進(jìn)行綜合評(píng)分 (其權(quán)重系數(shù)分別為:0.5、0.3、0.2)［5］，以綜合評(píng)分為標(biāo)準(zhǔn)，直觀分析表明，在所選因素水平范圍內(nèi)，各因素對(duì)有效成分提取量影響主次為A＞D＞B＞C，即乙醇體積分?jǐn)?shù)＞煎煮次數(shù)＞加醇倍量＞煎煮時(shí)間，直觀分析優(yōu)選出組合為A3B3C1D2，試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析詳見表4。

2.5 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)%(A)、煎煮次數(shù) (D)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響顯著 (P＜0.05)，加醇倍量 (B)、煎煮時(shí)間 (C)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均無顯著影響，優(yōu)選出組合為A3B3C1D2，與直觀分析結(jié)果相符合，即:加10倍量的80%的乙醇，提取兩次，每次1.0 h，方差分析結(jié)果見表5。

表5 方差分析Tab.5 Results of variance analysis

2.6 工藝驗(yàn)證 為進(jìn)一步考察優(yōu)選工藝的穩(wěn)定性，按照優(yōu)選出的最佳工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明:按提取工藝A3B3C1D2進(jìn)行提取，松果菊苷與毛蕊花糖苷含有量之和、馬錢苷的含有量和干膏得率的結(jié)果差異較小，重復(fù)性較好，結(jié)果見表6。

表6 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)Tab.6 Results of the test under optimized conditions

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇 蓯歸益腎膠囊為中藥復(fù)方制劑，處方由肉蓯蓉、山茱萸等六味中藥組成，肉蓯蓉為方中君藥，現(xiàn)代藥理研究顯示，其所含苯乙醇苷類成分松果菊苷、毛蕊花糖苷均是主要活性成分和質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分，具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、增強(qiáng)記憶等作用，與中醫(yī)傳統(tǒng)理論肉蓯蓉具有補(bǔ)腎陽、益精血、潤腸燥、通便之功效相契合，醇提法可有效提取其活性成分［7-9］;臣藥山茱萸中環(huán)烯醚萜總苷能夠抑制免疫作用、抗炎、抗血栓等，減輕氧化應(yīng)激損傷，有效對(duì)抗糖尿病血管并發(fā)癥，與肉蓯蓉合用有協(xié)同作用［10-11］。因此，從君藥、臣藥中分別選取有效成分作為指標(biāo)有助于全面的評(píng)價(jià)提取工藝。

3.2 UPLC色譜條件的建立 本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-PDA雙通道檢測(cè)技術(shù)，可同時(shí)測(cè)定君藥肉蓯蓉中松果菊苷、毛蕊花糖苷及臣藥山茱萸中馬錢苷含有量，流動(dòng)相選擇和溶劑梯度的設(shè)置最初參照2010年版《中國藥典》一部中肉蓯蓉含量測(cè)定方法，但所得基線不平穩(wěn)，分離度不理想，據(jù)分析與供試品中成分較為復(fù)雜有關(guān)，為兼顧松果菊苷、毛蕊花糖苷、馬錢苷的測(cè)定，結(jié)合UPLC的特點(diǎn)，經(jīng)過多次預(yù)實(shí)驗(yàn)，增加梯度設(shè)置，有助于更好地分離供試品中成分，選擇的梯度洗脫方法快速、穩(wěn)定、分離度好、測(cè)定數(shù)值較準(zhǔn)確。

3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 本實(shí)驗(yàn)通過正交設(shè)計(jì)優(yōu)選的蓯歸益腎膠囊最佳提取工藝為為:加10倍量的80%乙醇，提取兩次，每次1.0 h。研究顯示，肉蓯蓉中苯乙醇苷類化合物易發(fā)生氧化及水解而被破壞，松果菊苷、毛蕊花糖苷等腎臟保護(hù)有效成分隨著煎煮時(shí)間的延長呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)［12］。這與本實(shí)驗(yàn)顯示的煎煮1 h有效成分含有量高于提取1.5 h和2 h的現(xiàn)象一致，提示了科學(xué)優(yōu)選中藥制劑生產(chǎn)工藝具有重要意義，能有效節(jié)省時(shí)間和能源，并有助于提升藥品的質(zhì)量，提高制劑穩(wěn)定性和有效性［13］。工藝驗(yàn)證試驗(yàn)與正交試驗(yàn)結(jié)果基本一致，證明優(yōu)選最佳工藝穩(wěn)定、重復(fù)性好，為該制劑的提取工藝參數(shù)確定提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為該制劑中藥新藥的開發(fā)奠定了一定的基礎(chǔ)。

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