龐曉斌，謝欣梅，，王保全，李曉婷

(1.河南大學藥物研究所，河南開封 475004;2.河南大學淮河臨床醫(yī)學院，河南開封 475001;3.河南大學藥學院，河南開封 475004)

血腦屏障 (blood-brain barrier)位于血液與中樞神經系統(tǒng) (centralnervoussystem，CNS)的神經組織之間，主要由腦微血管內皮細胞 (Brainvaseularendothelialeell，BVEC)、星形膠質細胞、周細胞、基底膜構成。血腦屏障的破壞可導致血管源性腦水腫，是腦缺血再灌注損傷后腦水腫的重要病理基礎［1-2］。

脈絡寧注射液源自著名醫(yī)方“四妙勇安湯”，由玄參、牛膝、石斛、金銀花等組成，化學成分包括香豆素類、苯丙素類、昆蟲變態(tài)激素、三萜皂苷等［3］，具有養(yǎng)陰清熱、活血化瘀的功效［4］。臨床上廣泛用于治療缺血性腦血管病［5］，療效可靠，副作用小。有研究表明脈絡寧注射液能明顯縮小大腦中動脈阻斷 (middle cerebral artery occlusion，MCAO)后引起的腦梗死范圍，降低毛細血管通透性，減輕腦水腫等作用，但目前作用機制尚不明確［6-7］。

本實驗采用MCAO栓線法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注 (ischemia/reperfusion，I/R)模型，通過觀察脈絡寧注射液對大鼠腦缺血再灌注后血腦屏障通透性及緊密連接相關蛋白緊密連接蛋白-1(zonular occludens protein-1，ZO-1)、閉合蛋白(occludin)表達的影響，探討其對血腦屏障的保護作用及其機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF級，體質量280～300 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號SCXY(京)2010-0009。實驗過程中大鼠的飼養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定，室溫 (25±2)℃，相對濕度 (55±5)%，燈光控制12 h晝夜交替。對實驗動物的所有操作均符合中國實驗動物倫理學的要求。

1.2 藥物 脈絡寧注射液 (金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠，批號20120654);依達拉奉注射液 (國藥集團國瑞藥業(yè)有限公司，批號201110302)

1.3 試劑 氯化-2，3，5-三苯基四氮唑 (2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)，伊文思藍 (Evans Blue，EB)購自Sigma公司;兔抗鼠ZO-1抗體、兔抗鼠occludin抗體購自Santa-Cruz公司;辣根過氧化物酶 (HRP)標記的羊抗兔IgG抗體購自美國Pierce Biotechnology公司;SABC免疫組化染色試劑盒和DAB顯色劑購于武漢博士德生物技術研究所。

1.4 主要儀器 顯微鏡SZX16型(日本Olympus公司);冰凍切片機 (萊卡，德國);PowerGen 125型組織勻漿機 (賽默飛世爾公司);GS-15R離心機 (Beckinan公司，美國)。

2 方法

2.1 動物分組及處理 72只成年健康雄性SD大鼠，隨機分為假手術組、缺血再灌注模型組、伊達拉奉給藥組 (3 mg/kg)、脈絡寧高、中、低劑量組 (4、2、1 mL/kg)，每組12只。各組分別于再灌注即刻由尾靜脈注射給藥，假手術組與模型組分別給予2 mL生理鹽水。

2.2 大腦MCAO法建立大鼠腦缺血再灌注 (I/R)模型 SD大鼠術前12 h禁食，10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定。參照Longa等的大腦中動脈線栓法，造成右側大腦中動脈阻塞［8］。缺血2 h后，將栓線向外拉出至頸內實現再灌注。按照Longa等評分標準，各組分別在再灌注24 h進行評分:0分，正常，無神經學征象;1分，動物不能完全伸展右前肢;2分，動物右側肢體癱瘓，行走時向右側轉圈，出現追尾現象;3分，動物行走向右側跌倒，或動物不能站立或動物打滾;4分，無自發(fā)活動，有意識障礙。神經功能評分在1～3分為模型成功。0分和4分為模型不成功予剔除，在后續(xù)實驗中補充剔除出組的動物，保證每組動物數。假手術組只進行術前麻醉和血管分離術，不結扎及導入線栓。

2.3 腦梗死體積的測定 各組取再灌注24 h后的大鼠3只，以10%水合氯醛(350 mg/kg體質量)行腹腔注射麻醉，開胸暴露心臟，經心臟灌流生理鹽水固定。斷頭取腦，迅速將取出的腦組織置于－20℃冰箱，10 min后置室溫環(huán)境，將腦從額極至枕葉連續(xù)冠狀切面，厚約2 mm，共5層。然后迅速將腦片置于5 mL含2%TTC的溶液中，37℃恒溫、避光孵育30 min，然后置于4%多聚甲醛溶液，4℃固定，數碼相機拍照，應用圖像分析系統(tǒng)軟件處理計算腦梗死體積。經TTC染色后，正常組織呈玫瑰紅色，梗死組織未被染色而呈白色。

2.4 血腦屏障通透性檢測 各組取大鼠3只，手術后 (給藥后)即刻由尾靜脈注射2%伊文思藍(EB)2 mL。再灌注24 h后，快速打開胸腔并暴露心臟，從左心室灌注生理鹽水直至流出無色液體，斷頭取腦，小心剝取右側大腦半球，電子天平精確稱量其濕質量后，加入甲酰胺，于45℃的水浴箱孵育24 h，3000 r/min離心15 min，取上清液，于620 nm處測定吸光度。根據EB溶液標準曲線，計算EB的水平 (μg/g腦質量)。

2.5 Western blot檢測ZO-1、occludin的表達 動物于再灌注24 h后，4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦，冠狀切取前囪前1.0 mm至前囪后3.0 mm的腦組織，進行勻漿;在冰上加蛋白裂解液裂解，然后在4℃下12000 r/min離心5 min，進行蛋白水平的測定;SDS-PAGE電泳，轉膜;ZO-1(1∶500稀釋)、occludin(1∶500稀釋)，4℃孵育過夜;相應二抗室溫孵育2 h;ECL發(fā)光，曝光，顯影，對膠片進行掃描與拍照，采用圖像分析系統(tǒng)進行顯影條帶灰度值分析。

2.6 統(tǒng)計學方法 實驗數據用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件分析，所得結果以表示，組間均數的比較采用t檢驗，兩組以上均數的比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 脈絡寧對腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積的影響 結果顯示，腦缺血2 h再灌注24 h后，假手術組無腦梗死出現，模型組的腦梗死明顯;與模型組相比，脈絡寧各劑量組腦梗死體積縮小明顯，差異顯著 (P＜0.05)。見圖1。

圖1 脈絡寧對腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積的影響 (，n=3)Fig.1 Effects of Mailuoning on brain infarct volume in I/R rats(，n=3)

3.2 脈絡寧對大鼠缺血再灌注腦組織血腦屏障通透性的影響 結果顯示:與假手術組相比，模型組大鼠腦組織EB水平明顯升高，差異顯著 (P＜0.01);與模型組相比，各用藥組大鼠腦組織EB水平明顯降低 (P＜0.01或 P＜0.05)，以脈絡寧高劑量組減低最為顯著 (P＜0.01)。見表1。

表1 脈絡寧對腦缺血再灌注大鼠腦組織血腦屏障通透性的影響 (，n=3)Tab.1 Effects of Mailuoning on permeability of bloodbrain barrier in brain tissue of I/R rats(，n=3)

表1 脈絡寧對腦缺血再灌注大鼠腦組織血腦屏障通透性的影響 (，n=3)Tab.1 Effects of Mailuoning on permeability of bloodbrain barrier in brain tissue of I/R rats(，n=3)

注:與假手術組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

組別 動物/只 劑量 EB水平/(μg·g－1)5.85±0.28模型組 3 － 26.55±3.46＊＊依達拉奉 3 3 mg/kg 17.32 ±2.87＊▲脈絡寧組(高) 3 4 mg/kg 10.53±1.56＊▲▲脈絡寧組(中) 3 2 mg/kg 18.46 ±1.31＊▲脈絡寧組(低) 3 1 mg/kg 20.58±2.56假手術3－＊▲

3.3 脈絡寧對腦缺血再灌注大鼠ZO-1、occludin蛋白表達的影響 結果顯示，與假手術組相比，模型組腦組織中ZO-1和occludin的表達量明顯下降(P＜0.01)，表明緊密連接的破壞;與模型組相比，各給藥組ZO-1和occludin兩種蛋白的表達均明顯增加 (P＜0.01或P＜0.05)，以脈絡寧高劑量組降低最為顯著，顯示了脈絡寧對內皮細胞緊密連接的保護作用。見圖2。

4 討論

血腦屏障是維持腦內微環(huán)境穩(wěn)定、保障大腦正常功能的重要生理屏障［1］。腦缺血后血腦屏障的損傷既是損傷結果，也是進一步觸發(fā)損傷的原因，是腦缺血級聯(lián)損傷的重要病理過程。本實驗采用依文思藍滲透法檢測通透性，結果顯示，模型組EB水平明顯增加，與假手術組比較有顯著差異，說明腦缺血再灌注可造成血腦屏障的損傷，使血腦屏障的通透性增加;與模型組比較脈絡寧各劑量組腦EB水平均有所降低，表明脈絡寧能有效降低腦缺血再灌注所致的血腦屏障通透性增加，對血腦屏障結構有一定的保護作用。

圖2 脈絡寧對腦缺血再灌注大鼠腦組織ZO-1、occludin蛋白表達的影響 (，n=3)Fig.2 Effects of Mailuoning on ZO-1，occludin proteins expression in brain tissue of I/R rats(，n=3)

血腦屏障主要包括3層結構:腦血管內皮細胞、基底膜和星形膠質細胞終足。腦微血管內皮細胞之間的緊密連接 (tightjunction)是細胞間的通透屏障，通過細胞旁路徑調控水、離子和大分子物質的跨膜轉運［9］。緊密連接由ZO-1、occludin及細胞骨架蛋白等相連而成。ZO-1和occludin是內皮細胞緊密連接的主要結構蛋白，ZO-1在緊密連接的組成中居于核心地位［10］。有多項研究表明，緊密連接蛋白表達量的改變，位置分布的變化或結構功能的異常均可能破壞緊密連接的完整性，引起細胞間連接的開放，導致血腦屏障通透性的改變［11-12］。多項研究表明，急性腦缺血的情況下，血腦屏障的通透性增加，生理狀態(tài)下不能通透的物質可以穿越血腦屏障，到達組織間隙［13-14］。本實驗結果顯示，腦缺血再灌注24 h后模型組大鼠缺血區(qū)腦組織ZO-1和occludin蛋白表達明顯下降，說明血腦屏障的結構基礎破壞，導致血腦屏障通透性的改變，加重腦缺血再灌注損傷。脈絡寧能顯著提高ZO-1和occludin蛋白的表達，改善血腦屏障功能，起到腦缺血再灌注損傷的保護作用。

綜上所述，脈絡寧對腦缺血再灌注后血腦屏障的破壞有保護作用，其機制可能與上調ZO-1和occludin，修復微血管內皮細胞之間的緊密連接有關。

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