劉江華，戴碧濤，張 妮，梁紹燕，于 潔

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液腫瘤科，兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預(yù)防國(guó)際科技合作基地，重慶 400014)

芹菜素 (化學(xué)名4'，5，7-三羥基黃酮)是一種多酚類黃酮化合物，廣泛分布于芹菜、洋蔥、橘子等多種水果和蔬菜中，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等藥理活性，其中以抗腫瘤作用最為突出［1-2］。實(shí)驗(yàn)證明，芹菜素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡的作用，如肺癌NCI-H460細(xì)胞［3］、胃癌 SGC-7901 細(xì)胞［4］、卵巢癌 CAOV3 細(xì)胞［5］、膀胱癌BIU-87細(xì)胞［6］等。對(duì)白血病的研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素在體外能誘導(dǎo)急性早幼粒白血病細(xì)胞株HL-60發(fā)生凋亡［7］，在體內(nèi)能夠抑制小鼠移植性白血病腫瘤的生長(zhǎng)［8］，但其抗白血病作用的機(jī)制尚不明確。

SALL4是新發(fā)現(xiàn)的癌基因，位于20q13，編碼一種鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，其異常表達(dá)與白血病的發(fā)生及預(yù)后密切相關(guān)。SALL4過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠最終發(fā)生了急性髓細(xì)胞白血病，且在不同類型的白血病細(xì)胞株及病人中都檢測(cè)到了SALL4的高表達(dá);SALL4致白血病的機(jī)制可能是通過(guò)激活造血干細(xì)胞自我更新的重要通路 Wnt/β-catenin通路實(shí)現(xiàn)的［9-10］。

芹菜素作為潛在的抗腫瘤藥物，對(duì)SALL4基因及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響目前未見(jiàn)報(bào)道。本研究選擇急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株U937作為研究對(duì)象，探討芹菜素對(duì)U937細(xì)胞增殖凋亡及SALL4基因和Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 芹菜素 (純度＞95%)、二甲基亞砜 (DMSO)購(gòu)自Sigma公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清 (FBS)購(gòu)自Hyclone公司;CCK-8試劑購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自欣博盛生物科技有限公司;TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR GreenⅡ熒光染料購(gòu)自Takara(大連寶生物生物工程有限公司);SALL4多抗購(gòu)自 GeneTex公司，Bcl-2、Caspase-3單抗購(gòu)自Cell Signaling公司，β-actin單抗及羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司。實(shí)驗(yàn)前將芹菜素溶解在DMSO溶劑中，配成39.2 mmol/L的濃縮液，－20℃貯存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)時(shí)用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成芹菜素工作液，DMSO終質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.4%以下，預(yù)實(shí)驗(yàn)證明該質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) 人U937細(xì)胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒科研究所傳代凍存。復(fù)蘇后培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的 RPMI-1640培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U937細(xì)胞，加入不同體積的芹菜素濃縮液，使芹菜素終濃度分別為0、20、40、60 μmol/L(0組為對(duì)照組)。培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)芹菜素對(duì)U937細(xì)胞的增殖影響 將不同處理組細(xì)胞 (芹菜素終濃度分別為0、20、40、60 μmol/L)以1×105個(gè)/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL培養(yǎng)體系，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)12、24、36 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處每孔細(xì)胞的光密度值 (A)。按以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率 (%)=［(對(duì)照孔A值－加藥孔A值)/對(duì)照孔A值］×100%，并計(jì)算API處理U937細(xì)胞24 h的IC50。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期 收集不同濃度(0、20、40、60 μmol/L)芹菜素處理 24 h 的U937細(xì)胞，800 r/min離心5 min，棄上清，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，75%乙醇固定細(xì)胞。離心重懸細(xì)胞后加入碘化丙啶，4℃避光孵育1 h后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集不同濃度 (0、20、40、60 μmol/L)芹菜素處理24 h后的細(xì)胞，800 r/min離心5 min，棄上清，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次。Binding Buffer重懸細(xì)胞后，取195 μL的細(xì)胞懸液加入5 μL的Annexin V-FITC，混勻后間隔3 min，再加入10 μL碘化丙啶，室溫避光孵育10 min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GeneBank中人SALL4(NM_020436.3)、C-Myc(NM_002467.4)、CCND1(NM_053056.2)、β-actin(NM_001101.3)基因序列設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1。引物均由上海英駿生物工程有限公司合成。

表1 熒光定量PCR引物序列Tab.1 Sequences of real-time PCR primers

1.2.7 熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)水平 收集不同濃度 (0、20、40、60 μmol/L)芹菜素處理36 h的細(xì)胞，按TRIzol試劑的操作說(shuō)明提取總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定 RNA濃度及純度，A260/A280為1.8～2.1者用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄條件為:37℃ 15 min，85℃ 5 s。以合成的cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，條件為:95℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)，65℃ ～95℃記錄熔解曲線。在Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀器上進(jìn)行反應(yīng)，以SYBR GreenⅡ作為熒光染料，記錄樣本的循環(huán)閾值 (Ct值)。目的基因Ct值減去內(nèi)參基因Ct值用ΔCt表示，處理組ΔCt值減去對(duì)照組 ΔCt值用ΔΔCt表示，以2－ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算各處理組相對(duì)于對(duì)照組基因表達(dá)水平的變化。

1.2.8 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 收集不同濃度 (0、20、40、60 μmol/L)芹菜素處理36 h的細(xì)胞，用蛋白裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，取50 μg蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉2 h，加一抗4℃孵育過(guò)夜，一抗稀釋度為SALL4(1∶800)、Bcl-2(1∶1000)、Caspase-3(1∶1000)、β-actin(1∶200)。TBST洗膜3次，加1∶1000稀釋的羊抗兔或羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h后，TBST洗膜，加入ECL發(fā)光成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示。兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)。以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芹菜素處理后U937細(xì)胞形態(tài)的變化 與對(duì)照組相比，隨著藥物濃度的增高，處理組的細(xì)胞密度逐漸降低，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，透明度逐漸下降，細(xì)胞碎片增多。其中60 μmol/L處理組可見(jiàn)大量細(xì)胞碎片，活細(xì)胞少見(jiàn) (圖1)。

圖1 不同濃度芹菜素處理U937細(xì)胞24 h后細(xì)胞形態(tài)的變化 (200×)Fig.1 Morphological changes of U937 cells after beging treated with different concentrations of apigenin for 24 h(200×)

2.2 芹菜素對(duì)U937細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組相比，處理組的細(xì)胞增殖明顯受抑制 (P＜0.01，表2)。同一時(shí)間點(diǎn)隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞增殖抑制率逐漸增高 (P＜0.05);同一藥物濃度，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率逐漸增高(P＜0.05)。說(shuō)明芹菜素對(duì)U937的增殖抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴性。24h的 IC50=32.18 μmol/L，36 h 的 IC50=22.37 μmol/L。

表2 芹菜素對(duì)U937細(xì)胞增殖抑制率的影響 (%，，n=3)Tab.2 Inhibition rates of U937 cells after beging treated with different concentrations of apigenin for different amount of time(%，，n=3)

表2 芹菜素對(duì)U937細(xì)胞增殖抑制率的影響 (%，，n=3)Tab.2 Inhibition rates of U937 cells after beging treated with different concentrations of apigenin for different amount of time(%，，n=3)

注:與對(duì)照組比較，＊＊P＜0.01

芹菜素/(μmol·L －1)12 h 24 h 36 h 000020 20.54 ±4.13＊＊ 36.74 ±2.57＊＊ 46.70 ±1.46＊＊40 32.04 ±2.96＊＊ 56.70 ±3.92＊＊ 66.82 ±1.77＊＊60 41.42±3.02＊＊ 66.35±3.34＊＊ 77.86±1.30＊＊

2.3 芹菜素對(duì)U937細(xì)胞周期的影響 與對(duì)照組相比，隨著藥物濃度的升高，G2/M期細(xì)胞比例增多 (P＜0.01)，S期細(xì)胞比例下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)(表3，圖2)。提示芹菜素對(duì)細(xì)胞周期的阻滯發(fā)生在G2/M期，且在一定范圍內(nèi)，與藥物劑量正相關(guān) (P＜0.01)。

表3 芹菜素作用24 h后U937細(xì)胞的周期分布 (%，，n=3)Tab.3 Cell cycle of U937 after beging treated with different concentrations of apigenin for different amount of time(%，，n=3)

表3 芹菜素作用24 h后U937細(xì)胞的周期分布 (%，，n=3)Tab.3 Cell cycle of U937 after beging treated with different concentrations of apigenin for different amount of time(%，，n=3)

注:與對(duì)照組相比，*P＜0.05

芹菜素/(μmol·L －1)G0/G1 S G2/M 060.49±6.70 38.91±6.28 0.60±0.4520 53.29±0.58 35.19±1.85 11.52±2.20*40 52.15±2.46 30.56±1.83 18.43±1.14*60 39.87±5.41 27.31±5.59 29.34±0.68*

圖2 芹菜素作用24 h后U937細(xì)胞的周期分布Fig.2 Cell cycle of U937 after beging treated with different concentrations of apigenin for 24 h

2.4 芹菜素對(duì)U937細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組相比，隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞凋亡率逐漸增高(P＜0.05)，并在一定范圍內(nèi)有濃度依賴性 (P＜0.05，表4，圖3)。

表4 不同濃度芹菜素作用24 h對(duì)U937細(xì)胞凋亡率的影響(%，，n=3)Tab.4 Apoptotic rates of U937 cells after beging treated with different concentrations of apigenin for 24 h(%，，n=3)

表4 不同濃度芹菜素作用24 h對(duì)U937細(xì)胞凋亡率的影響(%，，n=3)Tab.4 Apoptotic rates of U937 cells after beging treated with different concentrations of apigenin for 24 h(%，，n=3)

注:與對(duì)照組相比，*P＜0.05

芹菜素/(μmol·L－1) 凋亡率/%3.42±1.1320 5.66±0.60*40 7.90±0.26*60 10.86±0.940*

2.5 芹菜素對(duì)SALL4及Wnt/β-catenin通路下游靶基因c-Myc、CCND1表達(dá)的影響 隨著芹菜素濃度的升高，SALL4、c-Myc、CCND1的表達(dá)量逐漸下降。與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，表5，圖4)。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，SALL4與c-Myc、CCND1表達(dá)量正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.882和0.662，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。

表5 Real-time PCR檢測(cè)芹菜素作用36 h后SALL4、c-Myc、CCND1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量 (，n=3)Tab.5 Determination of relative expression of SALL4，c-Myc and CCND1 mRNA by real-time PCR(，n=3)

表5 Real-time PCR檢測(cè)芹菜素作用36 h后SALL4、c-Myc、CCND1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量 (，n=3)Tab.5 Determination of relative expression of SALL4，c-Myc and CCND1 mRNA by real-time PCR(，n=3)

注:與對(duì)照組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

芹菜素/(μmol·L －1)2 － ΔΔ Ct SALL4 C-MYC CCND101.00±0.12 1.00±0.04 1.00±0.0820 0.76±0.06* 0.71±0.04* 0.51±0.13＊＊40 0.53 ±0.06＊＊ 0.48 ±0.04* 0.36 ±0.05＊＊60 0.37±0.08＊＊ 0.24±0.09* 0.35±0.09＊＊

2.6 芹菜素對(duì)SALL4、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 芹菜素處理U937細(xì)胞36 h后，SALL4、Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，Caspase-3表達(dá)升高，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)(圖5)。

圖3 芹菜素作用24 h后U937細(xì)胞的凋亡率Fig.3 Apoptotic rates of U937 cells after beging treated with different concentrations of apigenin for 24 h

圖4 real-time PCR檢測(cè)各組細(xì)胞SALL4、c-Myc、CCND1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Determination of relative expression of SALL4，c-Myc and CCND1 mRNA in various groups by realtime PCR

3 討論

化療是兒童急性白血病和其他惡性腫瘤的主要治療手段，大劑量化療可以產(chǎn)生更強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞凋亡作用;然而化療藥物的毒副作用及耐藥問(wèn)題嚴(yán)重困擾著臨床治療。芹菜素作為一種天然植物成分，因其高效、低毒、無(wú)誘變性等特點(diǎn)，逐漸成為新興的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，20、40、60 μmol/L的芹菜素都表現(xiàn)出抑制U937細(xì)胞增殖的能力，且隨著藥物濃度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間和劑量依賴性。本研究還發(fā)現(xiàn)芹菜素能夠通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，印證了Budhraja的研究結(jié)果［8］。細(xì)胞增殖和凋亡的動(dòng)態(tài)平衡是維持機(jī)體正常狀態(tài)的重要條件，腫瘤的形成就是由于惡性細(xì)胞增殖加快、凋亡受阻，打破了這種動(dòng)態(tài)平衡所致。本研究的結(jié)果提示芹菜素能夠通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡，恢復(fù)正常的生理平衡，從而起到抗腫瘤的作用。

圖5 芹菜素處理后各組細(xì)胞SALL4、Bcl-2和Caspase-3的蛋白表達(dá)水平Fig.5 Protein expression levels of SALL4，Bcl-2 and Caspase-3 in U937 cells in various groups after apigenin treatment

細(xì)胞周期是一個(gè)復(fù)雜有序的生理過(guò)程，對(duì)維持機(jī)體正常功能具有重要作用，許多化療藥物就是通過(guò)作用于特定的細(xì)胞周期發(fā)揮作用的，如阿糖胞苷主要作用于S期，長(zhǎng)春新堿特異地作用于M期。在細(xì)胞周期的調(diào)控過(guò)程中，從G0期能否進(jìn)入S期、從G2期能否進(jìn)入M期是兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。若能阻斷細(xì)胞從某一時(shí)相進(jìn)入下一時(shí)相，導(dǎo)致細(xì)胞蓄積在特定時(shí)相，此時(shí)再給予該時(shí)相特異性藥物就能夠增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)芹菜素對(duì)U937細(xì)胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)不同濃度的芹菜素處理細(xì)胞后，引起G2/M期的細(xì)胞增多，說(shuō)明芹菜素對(duì)細(xì)胞周期的阻滯作用發(fā)生在G2/M期，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［11-12］。推測(cè)如果把芹菜素與G2/M期特異性化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，既可以增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷性，增加化療藥物的敏感性，又可以減少化療藥物的用量，降低藥物的毒副作用。

SALL4是果蠅Spalt的同源基因，在維持胚胎干細(xì)胞的多能性及自我更新中起著重要作用，其突變可導(dǎo)致畸形的發(fā)生，如Okihiro綜合征和IVIC綜合征［13-15］。在正常造血發(fā)育中，SALL4主要表達(dá)于CD34

+的造血干/祖細(xì)胞，隨著細(xì)胞的分化成熟，其表達(dá)量逐漸降低，在成熟造血細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，而在白血病細(xì)胞中表達(dá)升高［10］，提示SALL4可能參與了白血病的發(fā)生。有研究認(rèn)為SALL4可能通過(guò)與β-catenin結(jié)合，激活白血病自我更新的重要通路 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路［9］。c-Myc和 CCND1是Wnt通路中重要的下游靶基因。c-Myc是早期發(fā)現(xiàn)的原癌基因，控制細(xì)胞的增殖和分化，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。CCND1編碼的CYCLIN-D1是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的重要因子，過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞增殖。通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制SALL4的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，β-catenin 和 c-Myc、CCND1 的表達(dá)隨之下調(diào)［11］，提示阻斷SALL4可以抑制Wnt信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而可能抑制腫瘤的發(fā)生。關(guān)于芹菜素對(duì)SALL4基因及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的作用，此前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)熒光定量PCR及Western blot等技術(shù)檢測(cè)了芹菜素對(duì)SALL4及Wnt通路下游因子c-Myc、CCND1表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)芹菜素能下調(diào)SALL4、c-Myc、CCND1的表達(dá)，且 SALL4與 c-Myc、CCND1有明顯相關(guān)性，提示芹菜素可能通過(guò)抑制SALL4表達(dá)，阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮其抗白血病作用。

綜上所述，芹菜素對(duì)U937細(xì)胞有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用。其機(jī)制可能與抑制SALL4基因的表達(dá)，阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路，調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Caspase-3的表達(dá)有關(guān)。

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