陳嘉曦，李尚德

(廣東醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，廣東 東莞 523808)

廣東醫(yī)學(xué)院項(xiàng)目(M2012014)

*

陳嘉曦，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：藥物化學(xué)和生物化學(xué)；E-mail：cppcc@qq.com

離子液體微波輔助萃取穿心蓮中內(nèi)酯類化合物△

陳嘉曦*，李尚德

(廣東醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，廣東 東莞 523808)

目的以離子液體為萃取劑，采用微波輔助萃取法(MAE)對(duì)穿心蓮中的穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的萃取進(jìn)行研究。方法考察了溫度、時(shí)間、相比和原藥粒徑等因素對(duì)萃取效果的影響，比較了MAE和傳統(tǒng)溶劑回流萃取法(HRE)的萃取率。結(jié)果以離子液體([Bmim]Tf2N)為萃取劑，液固比(mL∶g)10∶1，80 ℃微波輔助萃取3 min，穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的萃取率分別為16.08 mg·g-1和4.76 mg·g-1。結(jié)論與傳統(tǒng)的萃取方法比較，本方法快速高效、對(duì)環(huán)境無污染。

穿心蓮；微波輔助萃?。浑x子液體；穿心蓮內(nèi)酯；脫水穿心蓮內(nèi)酯

穿心蓮Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees為爵床科穿心蓮屬植物，別名一見喜、斬蛇草、苦草、橄欖蓮，原產(chǎn)于印度，現(xiàn)廣泛分布于我國(guó)福建、廣東、廣西、海南、云南等地。穿心蓮為常用中藥，具有清熱解毒，涼血，消腫功能。用于感冒發(fā)熱，咽喉腫痛，口舌生瘡，頓咳勞嗽，泄瀉痢疾，熱淋澀痛，癰腫瘡瘍，蛇蟲咬傷[1]。

微波輔助萃取技術(shù)，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、適用范圍寬、萃取效率高、重現(xiàn)性好、節(jié)省時(shí)間、節(jié)省試劑等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物萃取[2]。在微波輔助萃取中草藥中有效活性成分時(shí)，萃取溶劑需要有一定的極性才能吸收微波進(jìn)行內(nèi)部加熱，通常選用極性較強(qiáng)的溶劑或者是極性溶劑和非極性溶劑的混合液，如甲醇、乙醇、二氯甲烷-甲醇、水-甲苯等，但這些揮發(fā)性有機(jī)溶劑在樣品前處理過程中會(huì)引起環(huán)境污染。最近幾年離子液體、表面活性劑等各種新型的綠色溶劑開始用于微波輔助萃取，并取得了良好的萃取效果[3]。離子液體是由有機(jī)陽(yáng)離子和無機(jī)(有機(jī))陰離子構(gòu)成的在室溫或接近室溫下(通常低于100 ℃)呈液體狀態(tài)的鹽類[4-6]，非常適合做MAE萃取溶劑，因?yàn)殡x子液體是由離子組成的，具有蒸氣壓低、揮發(fā)性小、溶解能力強(qiáng)、萃取能力好、液態(tài)范圍寬等獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，同時(shí)對(duì)微波具有強(qiáng)的吸收和熱轉(zhuǎn)換能力[7]。將離子液體作為萃取劑、微波吸收劑，采用微波輔助萃取，較好地發(fā)揮了離子液體與微波技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，為天然產(chǎn)物綠色、高效萃取提供了新方法。

本實(shí)驗(yàn)以穿心蓮藥材中穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide)、脫水穿心蓮內(nèi)酯(dehydroandrographolide)這兩種內(nèi)酯類化合物為目標(biāo)，以微波為輔助萃取手段、離子液體1-丁基-3-甲基咪唑雙三氟甲基磺酰亞胺鎓鹽([Bmim]Tf2N)為萃取劑及微波吸收劑，對(duì)影響萃取的主要因素，如萃取溫度、萃取時(shí)間、原藥粒徑、相比(固/液)等工藝參數(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并以反相HPLC為表征手段，對(duì)兩種穿心蓮內(nèi)酯類化合物進(jìn)行了定量分析，為中藥中活性成分的萃取開拓了新思路。

1 材料與儀器

1.1 試藥

穿心蓮樣品(湛江穿心蓮規(guī)范化種植基地，莖與葉混合)；穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品(批號(hào)：0797-200206)、脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品(批號(hào)：0854-200204)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。離子液體([Bmim]Tf2N)根據(jù)文獻(xiàn)所述方法制備[8]。產(chǎn)物用1H-NMR 和13C-NMR檢測(cè)離子液體的純度，NMR譜圖表明離子液體中沒有其他有機(jī)雜質(zhì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置與分析儀器

MDS-10高通量微波消解萃取合成工作站(上海新儀微波化學(xué)科技有限公司)；Agilent1100系列高效液相色譜儀，Agilent自動(dòng)進(jìn)樣器，Agilent DAD檢測(cè)器；Agilent extend C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

2 方法

2.1 微波輔助萃取(MAE)

將穿心蓮自然晾干、粉碎成粉、過篩，得到<0.096，0.096～0.15，0.15～0.18和0.18～0.25 mm 4種不同粒徑樣品。準(zhǔn)確稱取0.5 g穿心蓮樣品于放有轉(zhuǎn)子的反應(yīng)管中，加入5 mL[Bmim]Tf2N，用磁力攪拌器攪拌，使穿心蓮粉末盡量均勻分散在[Bmim]Tf2N相中。萃取實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用甲醇定容50 mL，待測(cè)。

2.2 溶劑回流萃取(SRE)

精密稱取穿心蓮藥材干燥粉末(60 ℃干燥)1.0 g，加甲醇100 mL，索氏提取至餾出液為無色(約3.5 h)，萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸出大部分溶劑，再用甲醇將其定容為100 mL。

2.3 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品和脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品適量，加甲醇溶解，搖勻，制成每l mL含穿心蓮內(nèi)酯0.1 mg和脫水穿心蓮內(nèi)酯0.1 mg的對(duì)照品溶液。

2.4 HPLC定量方法

分別準(zhǔn)確吸取穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液、樣品溶液5 μL，以0.45 μm微孔濾膜過濾，注入HPLC色譜儀，進(jìn)行分析，測(cè)定時(shí)間為1 h，流動(dòng)相為以甲醇-水(30∶70)0～60 min(60∶40)梯度洗脫，流速：1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：226 nm，柱溫：25 ℃。結(jié)果見色譜圖1、2。色譜圖中，在RT9.584、15.016、21.218、24.204、26.549、38.312、44.444和46.112處分別有明顯的色譜峰，這8個(gè)色譜峰為穿心蓮有效成分的主要特征色譜峰和共有色譜峰。

圖1 穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品HPLC圖

圖2 穿心蓮藥材HPLC圖

2.5 微波輔助離子液體萃取法的標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密稱取穿心蓮內(nèi)酯8.55 mg、脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品20.75 mg，置于50 mL 量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每l mL 中含穿心蓮內(nèi)酯171.0 μg和脫水穿心蓮內(nèi)酯415.0 μg的對(duì)照品溶液，備用。分別精密吸取上述對(duì)照品溶液1，2，4，6，8，10 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得穿心蓮內(nèi)酯回歸方程為Y=3.844×10-5X+2.575，r=0.999 9；脫水穿心蓮內(nèi)酯回歸方程為Y=5.840×10-5X+4.453，r=0.999 9。結(jié)果表明穿心蓮內(nèi)酯進(jìn)樣濃度在17.1～171 μg·mL-1與穿心蓮內(nèi)酯峰面積呈良好的線形關(guān)系。脫水穿心蓮內(nèi)酯進(jìn)樣濃度在41.5～415μg·mL-1與穿心蓮內(nèi)酯峰面積呈良好的線形關(guān)系。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取穿心蓮樣品0.5 g，分別精密加入混合對(duì)照品溶液(穿心蓮內(nèi)酯6.50 mg·mL-1、脫水穿心蓮內(nèi)酯2.00 mg·mL-1)1 mL，按照建立的微波輔助萃取方法提取，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 穿心蓮中兩種內(nèi)酯的回收率試驗(yàn)

注：穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品加入量為6.500 mg，脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品加入量為2.000 mg

3 結(jié)果

3.1 萃取影響因素

3.1.1 溫度對(duì)萃取的影響 如圖3所示，穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的萃取效率均隨溫度升高而提高，其中，穿心蓮內(nèi)酯的萃取效率在80 ℃時(shí)達(dá)最高，脫水穿心蓮內(nèi)酯在系統(tǒng)溫度為90 ℃時(shí)萃取率最高。因樣品中穿心蓮內(nèi)酯含量遠(yuǎn)高于脫水穿心蓮內(nèi)酯，綜合考慮，選擇實(shí)驗(yàn)萃取溫度為80 ℃。

3.1.2 時(shí)間對(duì)萃取的影響 如圖4所示，萃取在2 min時(shí)幾乎達(dá)到平衡，隨時(shí)間延長(zhǎng)，萃取效率幾乎沒有變化，因此實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間為3 min已經(jīng)能萃取完全。這也證明了微波輔助萃取法不僅能節(jié)約時(shí)間，同時(shí)在能量利用上也實(shí)現(xiàn)了節(jié)約、高效。

圖3 萃取溫度對(duì)萃取的影響

圖4 萃取時(shí)間對(duì)萃取的影響

3.1.3 粒徑對(duì)萃取的影響 對(duì)4種粒徑(<0.096，0.096～0.15，0.15～0.18、0.18～0.25 mm)穿心蓮樣品中穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的萃取進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)粒徑對(duì)萃取影響較小，萃取效率差別不大。

3.1.4 相比對(duì)萃取的影響 離子液體對(duì)穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的萃取效率在固體/液體比為1∶30～1∶10(g∶mL-1)沒有顯著變化?？梢?，在工藝條件允許范圍內(nèi)，相比對(duì)萃取影響較小，離子液體單次萃取并未達(dá)到飽和。基于以上數(shù)據(jù)，最終選擇1∶10(g∶mL)為最終提取的固液比條件。

3.2 微波輔助離子液體萃取與傳統(tǒng)萃取方法比較

如表2所示，微波輔助離子液體萃取法(MAE)對(duì)穿心蓮內(nèi)酯類化合物的萃取效率顯著比甲醇回流萃取法(HRE)高，對(duì)穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的提取率分別提高38%和33%。

對(duì)比MAE和HRE，在萃取穿心蓮樣品時(shí)，MAE具有較特別的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)機(jī)理[9-10]，在相同萃取條件下具有顯著的優(yōu)勢(shì)。從表2可知，采用MAE技術(shù)，利用離子液體([Bmim]Tf2N)為萃取劑，不僅穿心蓮內(nèi)酯類化合物的萃取率高，回收率好，并可避免揮發(fā)性有機(jī)溶劑的使用，另外微波萃取法用時(shí)短，所需溶劑量小。以固液比(g∶mL)10∶1、80 ℃微波輔助萃取3 min，穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的萃取率分別為16.08 mg·g-1和4.76 mg·g-1。

表2 穿心蓮微波輔助離子液體萃取與傳統(tǒng)萃取方法比較

4 討論

目前穿心蓮藥材及其制劑的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)多以穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量為指標(biāo)。《中國(guó)藥典》2010版規(guī)定穿心蓮藥材質(zhì)量控制方法為測(cè)定穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量，兩者的總量不得少于0.8%，本實(shí)驗(yàn)穿心蓮藥材的穿心蓮內(nèi)酯類化合物超過2.1%。上述研究結(jié)果表明，溫度是影響萃取的最主要因素。溫度較低時(shí)進(jìn)行微波輔助萃取，微波破壞細(xì)胞壁使有效成分得到釋放，在達(dá)到最大萃取效率前，萃取效率呈上升趨勢(shì)；達(dá)到某一溫度后，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完全被破壞；而當(dāng)萃取溫度超過該臨界溫度后，過高的溫度又會(huì)破壞或改變穿心蓮中某些成分的分子結(jié)構(gòu)，使表觀上萃取效率有所下降[11]。因此，可推斷微波輔助離子液體萃取效率的提高是微波破壞作用與熱效應(yīng)的協(xié)同作用，并且以離子液體為溶劑，采用微波輔助萃取的機(jī)理與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑的萃取機(jī)理基本一致[12]，采用該方法萃取穿心蓮中的穿心蓮內(nèi)酯類化合物，快速、高效，對(duì)環(huán)境無污染。

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Microwave-assistedExtractionofLactonefromAndrographisPaniculataUsingIonicLiquidMAEMethod

CHENJiaxi*，LIShangde

(SchoolofPharmacy，GuangdongMedicalCollege，Dongguan，523808，China)

A microwave-assisted extraction(MAE)method was used to extract andrographolide and dehydroandrographolide fromAndrographispaniculata(Burm.f.)Nees.Ionic liquid was employed as extractant.Influential factors such as system temperature，extraction time，phase ratio and particle size were examined.The yield of the two target ingredients was compared between MAE and solvent reflux extraction(HRE).The optimal MAE conditions were：the solvent was [Bmim] Tf2N solution，the ratio of liquid/solid(mL∶g)was 10∶1，the extraction temperature was 80 ℃，and time was 3 min.Under this condition，the yields of andrographolide and dehydroandrographolide were 16.08 mg·g-1and 4.76 mg·g-1respectively.

Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees；Microwave-assisted extraction；Ionic liquids；Andrographolide；Dehydroandrographolide

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.05.015

2013-12-24)