齊美娜，林冰，楊航，祁燈響，周禮青

(1.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省中藥民族藥創(chuàng)制工程中心，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué) 中藥天然藥研發(fā)中心，貴州 貴陽 550025)

中藥工業(yè)

貴州省科技廳重點實驗室計劃項目(黔科合計Z字[2010]4015)；貴州省高校工程技術(shù)研究中心建設(shè)項目(黔教合KY字[2012]018號)；貴州大學(xué)大學(xué)生“SRT計劃”項目[貴大SRT字(2012)68號]

*

林冰，副教授，研究方向：中藥質(zhì)量標準及中藥材開發(fā)利用；E-mail：362570847@qq.com

淡竹葉提取液對酪氨酸酶抑制作用研究△

齊美娜1*，林冰1，2，3*，楊航1，祁燈響1，周禮青1

(1.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省中藥民族藥創(chuàng)制工程中心，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué) 中藥天然藥研發(fā)中心，貴州 貴陽 550025)

目的研究淡竹葉提取液對酪氨酸酶的抑制作用，并以此優(yōu)選提取工藝。方法以酪氨酸酶抑制率為評價指標，通過正交試驗法對超聲提取淡竹葉的工藝進行優(yōu)選。結(jié)果淡竹葉的最佳提取工藝條件是60%的乙醇，超聲功率為90 W，超聲提取50 min。此條件下提取物對酪氨酸酶的抑制率可達78.0%，IC50值為6.27 g·L-1。結(jié)論淡竹葉提取液來源廣泛，提取方便，經(jīng)濟有效，可為開發(fā)植物源酪氨酸酶抑制劑提供一種新的選擇。

淡竹葉提取液；酪氨酸酶；抑制效果；正交試驗

淡竹葉LophatherumgracileBrongn.為禾本科多年生草本植物，廣泛分布于江蘇、浙江、江西、廣西、湖南、福建等地，并且在許多地區(qū)均有栽培，資源十分豐富[1]。酪氨酸酶(tyrosinase)是體內(nèi)合成黑色素的關(guān)鍵酶，它有兩個主要功能：一是作為單酚酶，羥基化單酚生成鄰二酚；二是作為雙酚酶，氧化鄰二酚生成鄰醌[2]，鄰醌再經(jīng)過一系列復(fù)雜反應(yīng)生成黑色素[3]。酪氨酸酶抑制劑可以抑制黑色素生成，在化妝品領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，此外，在醫(yī)藥、食品及農(nóng)業(yè)抗蟲領(lǐng)域也有應(yīng)用[4]。已有研究表明黃酮類化合物均對酪氨酸酶有一定的抑制作用[5]，而淡竹葉中含有豐富的黃酮類化合物[1]。目前國內(nèi)學(xué)者對淡竹葉提取物的研究多集中于抗氧化、抗炎、抗腫瘤等方面，對于其對酪氨酸酶的抑制鮮有報道。本文選取鄰苯二酚為底物，測定淡竹葉提取液對雙酚酶的抑制作用，以酪氨酸抑制率為評價指標，采用正交試驗的方法，對淡竹葉超聲提取工藝進行優(yōu)選。

1 儀器與試藥

紫外分光光度計(UV-1801，北京北分瑞利分析儀器)；電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱(DGG-9246A型，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；高速臺式冷凍離心機(TGL-18M，上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；手持式高速均質(zhì)機(FJ150，上海標本模型廠)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠)；電子天平(莆田市亞太計量儀器有限公司，顯示分度值：0.001 g)；萬能粉碎機(FW100型，天津市泰斯特儀器有限公司)，超聲波儀(KH-500DE型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)，移液槍(Tegen Beta，100～1 000 μL)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HB-8，上海梅香儀器有限公司)。

淡竹葉鮮品采收于貴州省貴陽市花溪區(qū)，經(jīng)貴州大學(xué)熊源新教授鑒定為禾本科植物淡竹葉LophatherumgracileBrongn.；新鮮土豆購于貴州省貴陽市花溪區(qū)；鄰苯二酚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉均為分析純；蒸餾水。

2 方法

2.1 材料預(yù)處理

新鮮土豆保存于4 ℃冰箱中，于使用前去皮洗凈切碎。淡竹葉鮮品切成小段于干燥箱中干燥至含水率約為10%，用粉碎機粉碎后過二號篩備用。

2.2 酪氨酸酶溶液的制備

取處理好的土豆樣品25 g置于100 mL的燒杯中，加入0.2 mol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.8)50 mL，用均質(zhì)機均質(zhì)2～3 min，再用6層紗布過濾，濾液用冷凍離心機離心5 min，取上清液備用[6]，以下簡稱酶液。

2.3 酪氨酸酶溶液最大吸收波長測定

于試管中依次精密加入0.1 mL酶液、0.2 mol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.8)2 mL，0.025 mol·L-1的鄰苯二酚溶液(用pH=6.8的磷酸鹽緩沖溶液配置)1 mL。25 ℃孵育5 min后，迅速放入分光光度計中，在360～500 nm進行光譜掃描，確定最大吸收波長λmax=408 nm[7]。

2.4 酪氨酸酶活性的測定

精密量取0.1 mL酶液，0.2 mol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.8)2 mL于試管中，25 ℃孵育10 min，再加入0.025 mol·L-1的鄰苯二酚溶液1 mL，搖勻，迅速放入分光光度計中，以0.2 mol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.8)為參比，在λmax處進行時間掃描，時間范圍0～300 s，掃描間隔為10 s，得到酶促反應(yīng)的時間曲線，取0～80 s曲線的斜率計算酶活力[7]，調(diào)節(jié)酶液濃度，使每次實驗酶活力值相同。

2.5 淡竹葉提取物對酪氨酸酶抑制率的測定

分別在4支試管中精密加入酶液、0.2 mol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.8)、蒸餾水及淡竹葉提取液，各溶液的加入量見表1。將4支試管在25 ℃孵育10 min后，分別加入0.025 mol·L-1的鄰苯二酚溶液1 mL，繼續(xù)在25 ℃孵育4 min，然后立即于λmax處測量其吸光度值。根據(jù)公式計算酪氨酸酶抑制率I。

I=[(Aa-Ab)-(Ac-Ad)]/(Aa-Ab)×100%

表1 酪氨酸酶抑制率實驗中各種溶液的加入量 /mL

2.6 單因素試驗

取粉碎過篩后的淡竹葉2.5 g，置于具塞錐形瓶中，分別采用超聲時間(20，40，60，80 min)，料液比(1∶20，1∶40，1∶60)，超聲功率(40，60，80，100 W)，乙醇濃度(50%，70%，90%)對淡竹葉進行提取，提取液抽濾，濃縮至無醇味，抽濾，定容至250 mL，相當于1 L溶液中含藥材10 g。按2.5項下進行酪氨酸酶抑制率測定。

2.7 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以酪氨酸酶抑制率為指標，設(shè)計正交試驗，對淡竹葉提取液的提取條件進行優(yōu)化。

2.8 驗證實驗及陽性對照實驗

照2.7項下篩選出的最佳提取工藝進行驗證實驗，照2.5項下的方法測定其酪氨酸酶抑制率，重復(fù)3次。同時，分別用1，3，5，7 g·L-1的維生素C(抗壞血酸)溶液代替提取液，照2.5項下的方法測定其酪氨酸酶抑制率。

2.9 不同濃度淡竹葉提取液對酪氨酸酶抑制作用的考察

照2.7項下篩選出的最佳提取工藝進行實驗，將得到的淡竹葉提取液稀釋定容，配制成1 L分別含藥材2.5，5.0，7.5，10.0 g的溶液，照2.5項下的方法測定其酪氨酸酶抑制率，并求算IC50值。

3 結(jié)果

3.1 酪氨酸酶活性的測定結(jié)果

酪氨酸酶酶促反應(yīng)的時間曲線見圖1?？梢钥闯?，酪氨酸酶溶液的吸光度在0～80 s與時間之間呈良好的線性關(guān)系。若定義在該反應(yīng)體系內(nèi)以每分鐘變化0.01A為一個活力單位(U)[3]，計算得出酶活力為12.9 U·min-1，表明該酶液有一定的酪氨酸酶活性，可以用于實驗。

圖1 酪氨酸酶酶促反應(yīng)的時間曲線

3.2 單因素試驗結(jié)果

3.2.1 超聲時間對酪氨酸酶抑制率的影響 超聲時間為20，40，60，80 min時，酪氨酸酶抑制率分別為41.7%，67.0%，54.8%，49.6%，故最佳超聲時間為40 min。

3.2.2 料液比對酪氨酸酶抑制率的影響 料液比為1∶20，1∶40，1∶60時，酪氨酸酶抑制率分別為66.7%，67.1%，71.4%，由于抑制率相差不大，考慮到抽濾時料液比為1∶20時溶劑殘留、1∶60時溶劑用量過大等問題，選取1∶40為最佳料液比。

3.2.3 超聲功率對酪氨酸酶抑制率的影響 超聲功率為40，60，80，100 W時，酪氨酸酶抑制率分別為65.1%，68.0%，74.0%，73.2%，故最佳超聲功率應(yīng)選擇80 W。

3.2.4 乙醇濃度對酪氨酸酶抑制率的影響 乙醇濃度為50%，70%，90%時，酪氨酸酶抑制率分別為66.5%，76.8%，52.1%，故最佳乙醇濃度為70%。

3.3 正交試驗結(jié)果

由單因素試驗結(jié)果可知，與其他因素相比，料液比對酪氨酸酶抑制率影響較小，故以超聲時間、超聲功率及乙醇濃度3個因素進行L9(34)正交試驗，正交試驗因素和水平見表2，正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表2 淡竹葉超聲提取正交試驗因素水平表

表3 淡竹葉超聲提取正交試驗設(shè)計及結(jié)果

由表3極差數(shù)據(jù)可知，對提取物中酪氨酸酶抑制率影響的主次順序為B>C>A，最佳提取條件為A3B3C1，即超聲50 min，超聲功率90 W，乙醇濃度60%。

3.4 驗證實驗及陽性對照實驗結(jié)果

3組驗證實驗的酪氨酸酶抑制率結(jié)果分別為78.0%，77.1%，77.7%，平均值為77.6%，高于正交試驗中各項結(jié)果，因此確定A3B3C1為最佳提取條件。陽性對照實驗中3 g·L-1的維生素C溶液對酪氨酸酶的抑制率為74.3%，與驗證實驗中淡竹葉提取物對酪氨酸酶的抑制率相當。

3.5 不同質(zhì)量濃度的淡竹葉提取液對酪氨酸酶的抑制結(jié)果

由圖2可以看出，對酪氨酸酶的抑制效果，隨淡竹葉提取液質(zhì)量濃度的增大而線性增加，由圖可計算得到IC50值為6.27 g·L-1。

圖2 不同質(zhì)量濃度的淡竹葉提取液對酪氨酸酶的抑制結(jié)果

4 討論

酪氨酸酶抑制劑在化妝品、醫(yī)藥、食品及農(nóng)業(yè)抗蟲等方面均有廣泛應(yīng)用，近年來從天然植物中尋找安全高效的酪氨酸酶抑制劑越來越受到人們的重視。本文以酪氨酸酶抑制率為指標，對中藥淡竹葉的超聲提取工藝進行優(yōu)選，得到其最佳提取條件為60%乙醇，超聲功率為90 W，超聲50 min。在此條件下，10 g·L-1的淡竹葉提取液對酪氨酸酶抑制率可達到78%。與3 g·L-1的維生素C溶液對酪氨酸酶的抑制效果相當，說明淡竹葉提取液具有較好的酪氨酸酶抑制能力。

酪氨酸酶是人體合成黑色素的關(guān)鍵酶，適當抑制酪氨酸酶活性可實現(xiàn)健康美白。淡竹葉提取液對酪氨酸酶的抑制效果在0～10 g·L-1隨質(zhì)量濃度的增加而線性增強，因此可通過調(diào)節(jié)提取液濃度，得到相應(yīng)的抑制效果。淡竹葉提取液來源廣泛，提取簡便，經(jīng)濟有效，可為開發(fā)植物源酪氨酸酶抑制劑提供選擇。

[1] 李志洲.淡竹葉總黃酮最佳萃取工藝及抗氧化性的研究[J].食品研究與開發(fā)，2008，29(11)：42-45.

[2] 傅博強，李歡，王小如，等.甘草黃酮類化合物對酪氨酸酶單酚酶的抑制[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17(4)：391-395.

[3] 魯衛(wèi)斌.酪氨酸酶的提取及其參與的羊毛抗菌整理[D].無錫：江南大學(xué)，2009.

[4] 鄒先偉，蔣志勝.植物源酪氨酸酶抑制劑研究進展[J].中草藥，2004，35(6)：702-705.

[5] 陳清西，林建峰，宋康康.酪氨酸酶抑制劑的研究進展[J].廈門大學(xué)學(xué)報，2007，46(2)：274-281.

[6] 樊倩，韋慶義，袁爾東，等.植物中酪氨酸酶及不同抑制劑對其活性的影響[J].食品工業(yè)科技，2012，33(10)：91-93.

[7] 黃浩，彭玲，劉臨，等.中藥白芨提取物對酪氨酸酶的抑制作用[J].日用品工業(yè)，2008，38(6)：374-377.

InhibitionEffectofLophatherumgracileBrongnExtractsonTyrosinase

QIMeina1*，LINBing1，2，3*，YANGHang1，QIDengxiang1,ZHOULiqing1

(1.PharmacyDepartment，GuizhouUniversity，Guiyang550025，China；2.EngineeringCenterforInnovativeTraditionalChineseMedicineandEthnicMedicineofGuizhouProvince，Guiyang550025，China；3.ResearchandDevelopmentCenterofTraditionalChineseMedicinalandNaturalProducts，GuizhouUniversity，Guiyang550025，China)

Objective：The inhibitory activity of theLophatherumgracileBrongn extracts against tyrosinase was investigated in the present work.MethodsThe extract technology ofL.gracilewas optimized by orthogonal experiment.The inhibitory activity of the extracts against tyrosinase was used as evaluating criterion.ResultsThe optimum extraction conditions were obtained as follows：ultrasonic power 90W，solvent of 60% ethanol and extracting 20 min.Under these conditions，the inhibition on effect of the extract obtained from extraction(containing 10 g·L-1)achieves inhibiti on rate of 78% and IC50of 6.27 g·L-1.ConclusionBecause of the wide source and high quality in effective extraction, it can provide a new reference for resource development ofL.gracile.

LophatherumgracileBrongn extract；tyrosinase；inhibitory action；orthogonal experiment

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.05.014

2013-11-17)