羅利瓊

(廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

白藜蘆醇 (Resveratrol)是多酚類化合物，主要來源于葡萄 (紅葡萄酒)等多種植物的果實，［1－3］有眾多的研究表明，白藜蘆醇對心腦血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、皮膚及其骨質(zhì)疏松等均有較強的生物活性。［4－6］近年來也有一些研究認(rèn)為，白藜蘆醇具有對抗黑色素的作用，其作用的主要機制為抑制酪氨酸酶 (Tyrosinase，TYR) 的生物活性。［4，7］酪氨酸酶抑制劑包括白藜蘆醇的研究報道較多，［8，9］其作用主要是減少人體皮膚黑色素的合成，從而達到美白、治療黃褐斑、雀斑的作用，因此，白藜蘆醇可用作化妝品的添加劑。［7，8］

酪氨酸酶是生物體合成黑色素的關(guān)鍵酶，人體表皮色素的深淺以及色素沉著疾病等均與酪氨酸酶的表達和在體內(nèi)的活性相關(guān)。［7］在藥品和食品方面，針對白藜蘆醇的研究較多，［2，4－6，10］而在化妝品中的應(yīng)用研究相對較少，因此國內(nèi)外許多研究者均致力于從天然中草藥中提取有效抑制黑色素的成分。［7，11］鑒于上述理由，論文主要研究雪梨中提取的酪氨酸酶，在體外實驗的條件下，溫度與白藜蘆醇濃度的變化對酪氨酸酶抑制效果的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

1)高速臺式冷凍離心機，型號:TGL－16，制造廠家:金壇市城東新瑞儀器廠;2)紫外可見分光光度計，型號:UV－4501S，制造廠家:天津市港東科技發(fā)展有限公司;3)組織搗碎勻漿機，型號:JJ－2，制造廠家:常州國華電器有限公司;4)磁力攪拌器，型號:ZNCL－BS，制造廠家:上海一科儀器有限公司;5)電子分析天平，制造廠家:廈門精藝興業(yè)科技有限公司;循環(huán)水真空泵，型號:SHZ－Ⅲ，制造廠家:上海亞榮生化儀器廠;數(shù)顯恒溫水浴鍋，型號:HH－4，制造廠家:常州國華電器有限公司。

1.2 主要試劑

1)新鮮雪梨從市場上購得。2)95%白藜蘆醇，湖北巨勝科技有限公司，CAS號:501－36－0，規(guī)格:HPLC 95%，分子式:C14H12O3，分子量:228.24。3)60%乙醇、鄰苯二酚、丙酮、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉均為國產(chǎn)分析純。

1.3 溶液的配制

1)磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉按比例配制pH6.8的磷酸緩沖溶液。

2)精確稱取1.100g鄰苯二酚溶于1000mL磷酸緩沖液中，配制成10mmol/L的鄰苯二酚溶液，再稀釋成所需濃度的溶液。

3)白藜蘆醇溶液的配制 精確稱取0.0228g 95%的白藜蘆醇溶于10mL 60%的乙醇中，配制成10mmol/L的白藜蘆醇溶液，再稀釋成所需濃度的溶液。

1.4 酪氨酸酶的提取

1)取新鮮雪梨果肉組織150g加入－20℃的冰丙酮300mL，用高速組織搗碎機勻漿5min，0℃條件下抽濾，用冰丙酮反復(fù)沖洗殘渣，吸濾至白色粉末即為丙酮粉，－20℃保存?zhèn)溆谩?)取丙酮粉3g加入pH值6.8的磷酸緩沖液60mL，0℃條件用磁力攪拌器勻漿15min。3)調(diào)節(jié)冰凍高速離心機溫度至－2℃、轉(zhuǎn)速12000rpm，離心30min后取上清液，得酪氨酸酶提取液。［2，3］

2 結(jié)果

2.1 酪氨酸酶的吸收波長與活性

圖1 酪氨酸酶的吸收圖譜

酪氨酸酶活力的測定方法參照文獻［12，13］稍加修改進行。取1mmol/L鄰苯二酚溶液2.9mL加入比色杯中，再加入酪氨酸酶提取液0.1mL，30℃水浴3min;對照則加水0.1mL;在波長350～600nm范圍內(nèi)測其吸光度 (A)，確定以鄰苯二酚為底物的酪氨酸酶產(chǎn)物的最大吸收波長為412nm，詳細(xì)見圖1。

2.2 溫度對酪氨酸酶活性的影響

不適宜的溫度會破壞酶活性部位三維結(jié)構(gòu)的完整性，而它又是保持酶活力的關(guān)鍵，因此溫度是影響酶活性的一個重要因素。［11］

分別取1mmol/L鄰苯二酚2.9mL加入8個比色杯中，將數(shù)顯恒溫水浴鍋溫度分別設(shè)置10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃ 和 45℃，預(yù)浴后加0.1mL酪氨酸酶提取液，對照0.1mL蒸餾水，立刻混勻，在恒溫下測定波長為412nm的吸光度值隨時間的增長值，從直線斜率求得酪氨酸酶活力，作溫度與酶活力關(guān)系圖。圖2顯示，隨著溫度的升高，酪氨酸酶的活性不斷提高，30℃達到最佳活性后，酪氨酸酶的活性又逐漸降低。當(dāng)溫度達到50℃，可近似地認(rèn)為酪氨酸酶已沒有活性，即酪氨酸酶失活。因此調(diào)節(jié)溫度能有效地改變酪氨酸酶的活性。

酪氨酸酶活力計算方法:酪氨酸酶的相對活性=時間掃描圖中每條直線的斜率。

圖2 溫度的變化對酪氨酸酶活性的影響

3.3 白藜蘆醇濃度對酪氨酸酶活性的影響

分別取1mmol/L鄰苯二酚2.8mL加入5個比色杯中，30℃恒溫水浴后加0.1mL酪氨酸酶提取液，再分別加入0.1mL不同濃度 (分別為1.25、2.5、5、8、10mmol/L)的抑制劑白藜蘆醇，立刻混勻，將紫外可見分光光度計波長調(diào)為412nm，在恒溫下測定吸光度值隨時間的增長值，從直線斜率求得酶活力。以不加效應(yīng)物為對照，測定酶的相對剩余活力，結(jié)果表明白藜蘆醇對酪氨酸酶有顯著的抑制作用，隨著效應(yīng)物濃度的增大，酶活力下降(見圖3)。白藜蘆醇濃度在0－10mmol/L之間，抑制率上升較快，酶活力下降較為顯著，其半數(shù)抑制率IC50為5.3mmol/L(見圖4)。

相對酶活力 (%)=(A1－A0)/A1×100%，式中A1為含有底物、酶時測活體系的吸光度值，A0為含有底物、酶、白藜蘆醇時測活體系的吸光度值。

圖3 不同濃度白藜蘆醇與酪氨酸酶吸光度的變化

圖4 白藜蘆醇濃度與酪氨酸酶活性抑制率的關(guān)系

3 討論

白藜蘆醇是一種來源于植物的天然提取物，無毒無害，其生物學(xué)作用眾多，主要表現(xiàn)在抑制酪氨酸酶活性從而具有增白美白效應(yīng)，同時還具有抗氧化、抗自由基、抗炎、抗菌、抗血栓、減肥等效應(yīng)。［4－8］

本研究通過實驗方法，確定了以鄰苯二酚為底物的酪氨酸酶產(chǎn)物的最大吸收波長為412nm，將紫外可見分光光度計波長調(diào)為412nm，測定的吸光度值隨時間的增長值，通過圖2中的直線斜率得到酪氨酸酶的相對活性，當(dāng)溫度為30℃時酪氨酸酶的活性最大。在上述確定的最佳條件下，白藜蘆醇對酪氨酸酶有顯著的抑制作用，隨著效應(yīng)物即白藜蘆醇濃度的增大，酪氨酸酶的活力逐漸下降，其半數(shù)抑制率IC50為5.3mmol/L。研究結(jié)果表明，在實驗室條件下，白藜蘆醇有較強的抑制酪氨酸酶的作用，至少理論上可以表明白藜蘆醇可以考慮應(yīng)用于化妝品，以增加化妝品的美白效應(yīng)。

上述研究結(jié)果與其他研究類似，包括其熱穩(wěn)定性，白藜蘆醇對酪氨酸酶的抑制作用和白藜蘆醇的分離等等。［3，14，15］本研究方法操作簡單易行，便于快速提取植物中的酪氨酸酶，測定白藜蘆醇對酪氨酸酶的抑制作用時，設(shè)備、試劑與條件相對易得，可以用此方法快速篩選許多植物中酪氨酸酶，并通過新的設(shè)計方案測定植物中酪氨酸酶活性的大小或含量。其缺點是，從新鮮雪梨中得到的酪氨酸酶提取液中的酪氨酸酶含量，利用此方法并不能確定，因此，得到的結(jié)果也只能是相對的。

毫無疑問白藜蘆醇具有眾多的藥用價值，除此之外還可以用作食品添加劑和美容化妝品的添加劑，［16］由于其具有較強的抑制酪氨酸酶的作用，理論上具有美白作用，但是，作為化妝品中的添加劑，白藜蘆醇是否可以通過皮膚吸收、吸收的速度及其在什么條件下吸收效率最佳等等，這些問題仍然值得進行研究。

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