陳東波，曾繁濤

(1.廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，廣東 廣州 510006;2.深圳市第四人民醫(yī)院藥劑科，深圳 518033)

隨著臭氧層日益變薄，到達地面的紫外線不斷 增多。紫外線造成的皮膚光老化及相關(guān)疾病也隨之

增加。紫外線長期照射，可致曝光部位皮膚色素沉著、粗糙、干燥、皺紋加深等。甘草為豆科植物光果甘草、烏拉爾甘草、脹果甘草的干燥根及根莖。其所含甘草黃酮類化合物為主要活性成份，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、抗?jié)?、護肝等藥理作用，其中的異甘草素還具有抗腫瘤作用。［1～2］目前，從各種甘草中分離出黃酮類化合物有150余種之多，表現(xiàn)有良好的抗氧化活性，可作為自由基清除劑，使正常細胞免受氧化損傷。［3］本研究觀察皮膚外用甘草黃酮對紫外線照射引起的小鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)，SOD、GSH－Px、CAT、MDA、Hpy含量及Ⅰ型膠原蛋白mRNA的相對定量的影響，探討甘草黃酮對紫外線照射無毛小鼠皮膚的防護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 選取昆明種健康小鼠40只 (廣東藥學(xué)院實驗動物中心提供)，體重20～25g，雌性，隨機分為4組，每組10只:正常對照組，模型組，基質(zhì)組和甘草黃酮組。

1.2 甘草黃酮乳膏 取甘草黃酮 (由陜西華泰生物精細化工有限公司提供)及及乳劑基質(zhì) (液體石蠟、二甲硅油、白凡士林、丙二醇、甘油、乳化劑Einspire343、純化水等)按乳劑常規(guī)制備工藝流程制成水包油型甘草黃酮外用乳膏，其中甘草黃酮含量為5%。

1.3 試劑 皮膚丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH －Px)及羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)檢測試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品;總RNA提取試劑盒由北京天根生化科技有限公司提供;Real time PCR相關(guān)試劑由大連寶生物工程有限公司提供;cDNA合成試劑盒為美國MBI公司產(chǎn)品。

1.4 主要儀器 UVA和UVB紫外燈管 (合肥賽帆試驗設(shè)備有限公司，型號:UVA－340和UVB－313型);紫外－可見分光光度計 (日本島津，型號:UA－240);光學(xué)顯微鏡 (奧林巴斯公司，型號:BX53型);實時熒光定量PCR儀 (德國耶拿分析儀器股份公司，型號:qTOWER型)。

1.5 紫外線照射與給藥 將小鼠背毛剃凈，面積2cm×2cm。除對照組外，各組小鼠于紫外燈下(UVA+UVB，模擬日光)照射，照射距離50cm，1h/d，每周5次，連續(xù)8周。紫外線照射20min前，基質(zhì)組和甘草黃酮組小鼠于脫毛區(qū)分別定量均勻涂抹基質(zhì)乳膏和甘草黃酮乳膏。

1.6 測定皮膚組織SOD、GSH－Px、CAT、MDA、Hpy含量 取紫外線照射部位皮膚全層1g，放置－80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。制備皮膚組織勻漿液，按試劑盒說明書要求操作，分別檢測MDA、SOD、GSH－Px、CAT、Hyp水平。

1.7 測定Ⅰ型膠原蛋白mRNA的相對定量 以Trizol法提取皮膚組織總RNA，各總RNA樣本吸光度A260/A280值均為1.8～2.0。放置－80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。用隨機引物將各樣品總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。取總RNA 2.0μg加入20μl反應(yīng)體系中，依照2步反應(yīng)法得到的cDNA(65℃5min 1個循環(huán)，42℃60min 1個循環(huán))，于－20℃保存。依據(jù)Gen Bank相應(yīng)的cDNA序列 (NM007743.2，NM007393.3)進行BLAST分析，然后應(yīng)用Premier 5.0軟件，設(shè)計內(nèi)參照β－actin的引物和目的基因Ⅰ型膠原蛋白，于PCR儀上進行PCR擴增，同時擴增看家基因β－actin，校正加樣誤差。反應(yīng)完成后計算基因表達量。

1.8 觀察皮膚組織結(jié)構(gòu) 取紫外線照射部位皮膚0.3cm×0.3cm，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片、HE染色。采用光學(xué)顯微鏡觀察皮膚組織病理形態(tài)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 ()表示，行方差分析和t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 皮膚組織SOD、GSH－Px、CAT及MDA含量模型組與基質(zhì)組比較，兩組皮膚組織SOD、GSH－Px、CAT及MDA水平無明顯差異 (P＞0.05);與對照組比較，模型組皮膚組織SOD、GSH－Px、CAT水平顯著下降 (P＜0.01)，MDA水平顯著升高(P＜0.01);與模型組及基質(zhì)組比較，甘草黃酮組皮膚組織SOD、GSH－Px、CAT水平顯著升高 (P＜0.01)，MDA水平顯著下降 (P＜0.01)，見表1。

表1 小鼠皮膚組織SOD、GSH－Px、CAT及MDA含量比較 (n=10，x ±s，μmol/g Pro)

2.2 皮膚組織Hyp含量與Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達量 模型組與基質(zhì)組比較，兩組皮膚組織Hyp含量與Ⅰ型膠原蛋白相對含量無明顯差異 (P＞0.05);與對照組比較，模型組皮膚組織Hyp含量與Ⅰ型膠原蛋白相對含量顯著下降 (P＜0.01);與模型組及基質(zhì)組比較，甘草黃酮組皮膚組織Hyp含量與Ⅰ型膠原蛋白相對含量顯著升高 (P＜0.01)，見表2。

表2 小鼠皮膚組織Hyp含量與Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達量 (n=10，)

表2 小鼠皮膚組織Hyp含量與Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達量 (n=10，)

組別 Hyp(mg/g) Ⅰ型膠原蛋白相對含量對照組 3.37±0.581) 1.104±0.1251)模型組 2.46±0.41 0.548±0.062基質(zhì)組 2.54±0.47 0.581±0.069甘草黃酮組 3.15±0.561)2) 0.816±0.1071)2)

2.3 皮膚組織結(jié)構(gòu) 光學(xué)顯微鏡(10×40)下觀察顯示，模型組和基質(zhì)組表皮明顯增厚，組織結(jié)構(gòu)不完整，纖維組織排列紊亂，出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，可見炎性細胞浸潤，皮脂腺不規(guī)則增生。對照組和甘草黃酮組角質(zhì)層薄，表皮組織結(jié)構(gòu)完整，各層細胞清晰，真皮層纖維組織呈波浪狀均勻分布，見圖1～4。

圖1 模型組HE染色，10×40

圖2 基質(zhì)組HE染色，10×40

圖3 對照組HE染色，10×40

圖4 甘草黃酮組HE染色，10×40

3 討論

紫外線中的UVA和UVB波段是人體皮膚產(chǎn)生光老化的重要影響因子，紫外線輻射可增加氧自由基的生成，造成組織抗氧化能力降低，最終導(dǎo)致皮膚組織老化，這成為皮膚衰老的重要原因。［4］自由基可誘發(fā)生物膜不飽和脂肪酸—花生四烯酸過氧化，生成MDA等脂質(zhì)過氧化物的代謝物，其含量的升高可反映皮膚損傷程度的增加。SOD、CAT、GSH－Px等抗氧化活性酶物質(zhì)可以調(diào)節(jié)皮膚自由基的產(chǎn)生，清除多余的氧自由基，避免過早的皮膚衰老。本實驗結(jié)果顯示，紫外線輻射后，模型組小鼠皮膚組織中MDA水平較對照組顯著升高 (P＜0.01)，而皮膚組織中SOD、GSH－Px、CAT水平顯著下降 (P＜0.01);甘草黃酮組皮膚組織中MDA水平較模型組及基質(zhì)組顯著下降 (P＜0.01)，而皮膚組織中SOD、GSH－Px、CAT水平顯著升高 (P＜0.01)。

膠原纖維是真皮中的重要成分，主要為膠原蛋白，其含量會隨年齡的增長而明顯下降，從而導(dǎo)致皮膚彈性下降，皮膚松弛，因此，膠原含量的變化反映皮膚老化的程度。I型膠原蛋白是皮膚膠原蛋白的重要組成成分，紫外線輻射可影響其形成，從而導(dǎo)致成熟膠原束減少，皮膚出現(xiàn)松弛和皺紋。紫外線不僅可以使真皮中成熟膠原減少，［5－6］還可以下調(diào)Ⅰ型前膠原基因表達，損害新生膠原的生物合成，［7］使皮膚膠原蛋白減少。Hyp是真皮內(nèi)含量穩(wěn)定的氨基酸，其含量直接反映出真皮內(nèi)膠原纖維的含量變化，從而提示真皮衰老的程度。皮膚組織中Hyp含量變化是判定皮膚衰老程度的敏感指標(biāo)。［8］本實驗結(jié)果顯示，紫外線輻射后，模型組小鼠皮膚組織中Hyp含量與Ⅰ型膠原蛋白相對含量較對照組顯著下降 (P＜0.01);甘草黃酮組皮膚組織中Hyp含量與Ⅰ型膠原蛋白相對含量較模型組及基質(zhì)組顯著升高 (P＜0.01)。

綜上所述，甘草黃酮能夠提高紫外線輻射皮膚的抗氧化能力，加快清除氧自由基，并調(diào)節(jié)紫外線輻射后皮膚組織氨基酸代謝，增加皮膚膠原蛋白的含量，從而對紫外線照射無毛小鼠皮膚發(fā)揮防護作用，延緩皮膚光老化。

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