張連娣，王楚楚，林雁勤，陳 忠

(廈門大學(xué)物理系，福建 廈門 361005)

高分辨率的核磁共振 (Nuclear Magnetic Resonance，NMR)譜能為物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析及譜峰歸屬提供有價(jià)值的信息。自1945年底，Purcell小組和Bloch小組分別獨(dú)立地觀測(cè)到核自旋系統(tǒng)產(chǎn)生的NMR信號(hào)［1－3］以來(lái)，NMR展現(xiàn)出極強(qiáng)的生命力和廣闊的應(yīng)用前景，已成為物理學(xué)、化學(xué)、生物及醫(yī)藥［4］等領(lǐng)域最廣泛應(yīng)用且最有力的譜學(xué)工具之一。

然而，在過(guò)去的十多年間，在高極化 (高濃度)核自旋體系中卻出現(xiàn)了一些不能用常規(guī)NMR理論來(lái)解釋的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。1990年，Warren小組［3］在500M譜儀上采用三脈沖序列{(π/2)x－τ－(π/2)－x－t1－(π/2)x－t2}對(duì)80%H2O+20%D2O樣品做二維 (two Dimension，2D)譜實(shí)驗(yàn)時(shí)，在間接維(F1)觀察到了多量子相干 (Multiple－Quantum Coherence，MQC)信號(hào)。1993 年 Warren 小組［5，6］采用有梯度場(chǎng)參與的二脈沖序列 (即CRAZED脈沖序列)，對(duì)80%H2O+20%D2O樣品做2D譜實(shí)驗(yàn)時(shí)，再次發(fā)現(xiàn)相似的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。這些實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象都與傳統(tǒng)的NMR理論矛盾，據(jù)此Warren等從量子的角度指出這些峰是由分子間的偶極耦合作用產(chǎn)生的。之后在兩個(gè)假設(shè)［7］的基礎(chǔ)上，Warren等［6］提出了分子間多量子相干 (intermolecular Multiple－Quantum Coherence，iMQC)這一突破性概念。

決定NMR譜效用的關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)是線寬和線形，而傳統(tǒng)NMR信號(hào)的線寬和樣品感受到的磁場(chǎng)不均勻性密切相關(guān)，為了得到高分辨率的NMR譜，必須消除磁場(chǎng)不均勻性。而iMQC信號(hào)源于分子間遠(yuǎn)程偶極相互作用，其有效范圍在5－500μm之間，遠(yuǎn)小于樣品的一般尺寸，因此吸引譜學(xué)工作者將其應(yīng)用于不均勻場(chǎng)下獲取高分辨率譜。近年來(lái)，iMQC被證明是在不均勻磁場(chǎng)下獲得高分辨率NMR譜的非常有前景的方法。

1 分子間多量子相干的基本理論

自從iMQC概念提出后，由于其特有的性質(zhì)被廣泛用于在不均勻場(chǎng)下獲得高分辨率的NMR譜。而且高分辨率NMR譜的所有主要信息，包括化學(xué)位移、多重裂峰模式、耦合常數(shù)和相對(duì)峰面積，都能得以保留，這對(duì)物質(zhì)分析以及譜峰歸屬十分有利。

下面介紹一下由Warren小組首先提出的HOMOGENIZED(HOMOGeneity Enhancement by Intermolecular Zero－ quantum Detection)方法［8］，該方法在2D譜的F1維大大提高了譜圖的分辨率，序列如圖1所示。

圖1 基于分子間零量子相干的HOMOGENIZED序列

考慮一個(gè)由I和S兩種同核1/2自旋組分組成的均勻溶液，假設(shè)I為濃的單自旋體系溶劑，S為稀的或濃的AX體系溶質(zhì)，JAX為SA和SX的標(biāo)量耦合常數(shù)。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)探頭失諧［9］和不均勻場(chǎng)來(lái)消除輻射阻尼效應(yīng)，在下面的討論中忽略其影響。ωm為自旋m(m=I，SA，SX)在均勻場(chǎng)中的頻率偏置，ΔB(r)為磁場(chǎng)的空間不均勻性，考慮ΔB(r)后，自旋m在位置r的頻率偏置可表示為:Ωm(r)=ωm+ γ.ΔB(r)，(m=I，SA，SX，γ 為磁旋比) (1)

iZQC信號(hào)的進(jìn)動(dòng)頻率為:

(2)式表明分子間零量子相干 (intermolecular Zero－Quantum Coherence，iZQC)以兩自旋的進(jìn)動(dòng)頻率差演化，因?yàn)殚L(zhǎng)程偶極相互作用耦合的兩個(gè)自旋在空間位置上靠近，遠(yuǎn)小于偶極相關(guān)長(zhǎng)度dc=π/(γGδ)，G、δ分別為iZQC相干選擇梯度場(chǎng)脈沖的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。偶極相關(guān)長(zhǎng)度間兩自旋之間的磁場(chǎng)不均勻性幾乎相同，即 ΔB(r)≈ ΔB(r＇)，所以iZQC峰的進(jìn)動(dòng)頻率大約為 ωm－ωn，可見(jiàn)iZQC信號(hào)對(duì)磁場(chǎng)不均勻性不敏感，幾乎沒(méi)有不均勻展寬。

上面討論的是最早利用iMQC來(lái)獲得高分辨NMR譜的方法，之后也有對(duì)此序列的其他改進(jìn)，如在不均勻、不穩(wěn)定場(chǎng)下，lin等結(jié)合Carr－Purcell－Meiboom－Gill(CPMG)多自旋回波方法和HOMOGENIZED方法，設(shè)計(jì)出了CPMG－HOMOGENIZED高分辨序列，陳忠組改進(jìn)得到的SELHOMOGENIZED序列等。此外，其他用于獲得高分辨譜的脈沖序列也不斷涌現(xiàn)，如陳忠組提出的帶有溶劑峰壓制，［10，11］不同 J 耦合調(diào)制［12］等序列;Faber小組設(shè)計(jì)出的壓制溶劑峰的iZQC的改進(jìn)序列。［13］這些序列的基本原理都是利用iMQC。

2 分子間多量子相干方法在活體及生物組織中的應(yīng)用

在活體或者組織樣品中，磁場(chǎng)的均勻性往往受到樣品磁化率變化的影響 (如活體中骨頭與組織的交界處等)使磁場(chǎng)變得不均勻。在這種情況下，iMQC方法可用于消除不均勻場(chǎng)所帶來(lái)的不均勻增寬效應(yīng)，從而獲得高分辨率的NMR譜，對(duì)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行分析。近年來(lái)iMQC方法在生物組織和活體中有著廣泛的應(yīng)用。

2.1 分子間零量子相干方法的應(yīng)用

2.1.1 分子間零量子相干應(yīng)用于葡萄提高譜圖分辨率

由Warren等提出的HOMOGENIZED脈沖序列如圖2(a)，是利用iZQC來(lái)獲得2D譜并且可以在F1維得到高分辨率的NMR譜。2003年Faber小組在17.6T的場(chǎng)強(qiáng)下第一次把該序列應(yīng)用于活體譜。［14］

圖2 葡萄的HOMOGENIZED譜

圖2 為第一次在17.6T下把該序列應(yīng)用于完整葡萄獲得的譜圖。在僅僅6分鐘內(nèi)就得到能分辨出葡萄糖H1α和H1β峰的譜圖 (如圖2a)，該實(shí)驗(yàn)是為了優(yōu)化至在最短的采樣時(shí)間分辨出H1共振峰，因此只能分辨出部分葡萄糖峰。由于沒(méi)采用相位循環(huán)，譜圖中有殘留的COSY信號(hào)。圖2(b)為從含有1024個(gè)t1增量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)集中截取的256個(gè)t1增量，傅里葉變換為2048×512矩陣所得譜圖的放大區(qū)域。從譜中可以觀測(cè)到線寬從F2維大約0.12ppm下降到F1維大約0.04ppm。還可以觀測(cè)到位于3.22/4.63和3.54/5.23ppm處的譜峰，這些峰源于水和葡萄糖的α和β端基差向異構(gòu)體的H1/H2之間J－耦合的偶極耦合。位于4.38，2.96，2.78ppm處的3個(gè)峰為天冬氨酸 (Asp)的共振峰。HOMOGENIZED序列也可用于活體鼠腦［14］來(lái)提高譜圖分辨率。

HOMOGENIZED序列能用于活體中消除由磁化率梯度引起的譜線增寬，并能探測(cè)到活體中毫摩爾濃度的代謝物。假如HOMOGENIZED與定域譜結(jié)合將有可能應(yīng)用于包含空氣組織的NMR譜中，例如哺乳動(dòng)物的肺或植物的葉子等。

2.1.2 不均勻場(chǎng)下有效壓制溶劑峰的iZQC高分辨率譜在葡萄中的應(yīng)用

強(qiáng)大的溶劑信號(hào)一直以來(lái)都是獲得高分辨率NMR譜的障礙。2007年陳忠小組提出了一種能在不均勻場(chǎng)下有效壓制溶劑峰并能獲得高分辨譜的iZQC方法［10］(脈沖序列如圖3)。

圖3 iDQF－HOMOGRNIZED脈沖序列

黑條:硬RF脈沖，高斯形狀:只選擇自旋I(對(duì)應(yīng)溶劑)的RF脈沖

在該序列中假如相干選擇理想，射頻 (Radio Frequency，RF)脈沖α=π，β=π/2不僅能夠完全消除溶劑iZQC信號(hào)，而且需要的溶質(zhì)信號(hào)也能達(dá)到最大化。另外該序列獲得譜圖的J耦合常數(shù)和強(qiáng)耦合多重裂峰模式與常規(guī)1D譜一致，只是強(qiáng)耦合裂峰的強(qiáng)度會(huì)發(fā)生變化。

圖4 葡萄果肉的譜圖

分別來(lái)源于:(A)單π/2 RF脈沖;(B)iDQF－HOMOGENIZED譜切變后在F1維的1D投影譜;(C)均勻場(chǎng)下同樣葡萄汁液的1D常規(guī)譜;(D)和 (B)的數(shù)據(jù)相同的未經(jīng)切變的2D譜，插圖是放大的視圖

圖4A為葡萄果肉的常規(guī)1D譜，水峰線寬約為100Hz，從中幾乎無(wú)法得到任何代謝物信息。圖4B為經(jīng)過(guò)處理的iDQF－HOMOGENIZED的投影譜，其線寬明顯窄化，水峰抑制效果明顯，能分辨出水峰附近的beta－ (距水峰0.2ppm)和alpha－葡萄糖 (距水峰0.4ppm)，而在常規(guī)1D譜中完全被水峰淹沒(méi)。圖4D為沒(méi)有進(jìn)行切變處理的iDQF－HOMOGENIZED的2D譜，在譜峰重疊的區(qū)域內(nèi)，很多譜圖信息得以恢復(fù)。iDQF－HOMOGENIZED的1D投影譜與1D高分辨率葡萄汁的譜圖 (圖4C)較為相似，具有較理想的SNR。

雖然上述方法能有效壓制溶劑峰，但采樣時(shí)間較長(zhǎng)，在活體中應(yīng)用譜圖分辨率會(huì)受到一定的影響。Warren小組提出的超快速 iZQC方法［15］可以在單次數(shù)據(jù)采集掃描中獲得iZQC信號(hào)。這種方法可以看成在一次HOMOGENIZED實(shí)驗(yàn)中不同t1的四次疊加，采樣效率高。對(duì)于低溫下的變溫動(dòng)物該方法可以使譜圖的分辨率提高一個(gè)數(shù)量級(jí)，圖5為用該方法獲得的4°下活蚯蚓的譜圖，iZQC譜的F1維線寬比沿著直接維不均勻展寬的線寬窄很多。

圖5 4°時(shí)活蚯蚓的譜圖

2.1.3 基于iZQC的方法應(yīng)用于活體內(nèi)探測(cè)由飲食引起的脂肪組織成分的變化

脂肪酸在細(xì)胞代謝和人類疾病預(yù)測(cè)中有重要的作用，因此在活體內(nèi)探測(cè)組織脂肪酸成分的方法極其重要。2011年Warren小組提出了一種只需要單次實(shí)驗(yàn)就可以從分布于較大體積 (幾個(gè)立方厘米)的脂肪組織樣品中獲得脂肪成分信息的方法［16］(脈沖序列如圖6)。對(duì)于喂食富含多元不飽和脂肪酸 (Polyunsaturated Fatty Acid，PUFA)食物和標(biāo)準(zhǔn)食物的老鼠，該方法能區(qū)別出其脂肪組織成分的明顯不同。

圖6 iZQC脈沖序列

圖7 C為用該方法采得的譜圖，可以看出iZQC譜與標(biāo)準(zhǔn)1D譜對(duì)比分辨率明顯提高，壓水效果較好。另外CH2亞甲基質(zhì)子與下列基團(tuán)的耦合:CH3質(zhì)子 (P2－P1)，CH2(P2－P2)，烯基 (P2－P9)，烯丙基亞甲基 (P2－P4)，α亞甲基 (P2－P5)，二烯丙基亞甲基 (P2－P6)這些峰清晰可見(jiàn)。

圖7 肥胖老鼠的磁共振波譜

圖8 兩組老鼠的磁共振波譜

說(shuō)明iZQC方法對(duì)磁場(chǎng)不均勻不敏感，并且對(duì)源于瘠瘦組織的水信號(hào)有良好的壓制效果。圖8為兩組老鼠分別在4周和12周時(shí)圖7圈出譜峰區(qū)域的放大圖，在iZQC譜中明顯看出由于PUFA飲食引起的脂肪酸成分的變化，也被圖8G、H所證實(shí)。與PUFA相對(duì)應(yīng)的P6－P2峰，其強(qiáng)度在PUFA飲食組迅速增加，并且相對(duì)于P4－P2峰隨時(shí)間增加，反映了在PUFA飲食下脂質(zhì)成分隨時(shí)間的變化。

這種方法可用于分析小鼠體內(nèi)由飲食干預(yù)引起的脂肪組織成分的變化。另外該方法還被用于在活體內(nèi)探測(cè)棕色脂肪組織并用水－脂質(zhì)iZQC信號(hào)進(jìn)行表征。［17］由于其高分辨率和靈敏度，還將有可能用于研究其他高度不均勻器官 (如肝臟)的脂肪酸成分，而且對(duì)由運(yùn)動(dòng)以及脂肪代謝疾病引起的脂肪酸成分的微小變化的快速檢測(cè)也有一定的應(yīng)用前景。

2.2 分子間零量子相干方法與定域相結(jié)合及其在腫瘤和大鼠脊髓中的應(yīng)用

2006年Faber小組提出了三種可能把定域和HOMOGENIZED實(shí)驗(yàn)結(jié)合起來(lái)實(shí)現(xiàn)定域遠(yuǎn)程偶極場(chǎng)譜的方法，［18］但只有在采樣前定域的 S3方法(脈沖序列如圖9)能夠應(yīng)用于活體中得到充分空間選擇和良好靈敏度的譜圖。

圖9 采樣前定域的空間定域HOMOGENIZED譜的S3脈沖序列

黑條:非選擇性RF脈沖，sinc和gauss形:選擇性RF脈沖，t1和t2:時(shí)間間隔，深灰色梯形:片選梯度，灰色三角形:破壞梯度。

一般情況下隨著體素增大不均勻場(chǎng)增強(qiáng)，譜圖質(zhì)量和SNR會(huì)急劇惡化，而HOMOGENIZED譜不受其影響，反而隨著體素增大，SNR增加。為證明這一點(diǎn)，把S3序列應(yīng)用到大腿中植入一個(gè)直徑為5－7mm腫瘤的老鼠模型中。從這個(gè)模型的不同體素中分別采得了PRESS譜 (如圖10)。在 (2mm)3的體素中，觀測(cè)到Cho峰的線寬為85Hz。小尺寸腫瘤的不均勻結(jié)構(gòu)使從 (4mm)3，(6mm)3的體素中獲得譜圖的質(zhì)量下降 (圖10b、c)。而只要體素位于腫瘤結(jié)構(gòu)邊界以內(nèi)，定域iZQC譜不受所選體素體積大小的限制。圖11為用S3方法獲得的HOMOGENIZED定域譜的f1維投影譜，所用樣品與圖10相同，體素大小為 (6mm)3。(a)、(b)、(c)譜的采樣時(shí)間分別為25min，13min，7min，對(duì)應(yīng)Cho峰的線寬分別為55Hz，110Hz，220Hz。譜圖質(zhì)量不受體素大小的影響，但線寬隨t1增量的數(shù)目縮放，t1增量最小時(shí)，SNR最好。圖11還表明iZQC技術(shù)能有效壓制水和脂肪信號(hào)，而且對(duì)于較大體積體素的研究如整個(gè)腦代謝物，iZQC技術(shù)有明顯的優(yōu)勢(shì)。

圖10 含有FaDu腫瘤的活體老鼠的PRESS譜

圖11 S3序列獲得的含有FaDu腫瘤的活體老鼠((6mm)3體素)的iZQC定域譜的f1維投影譜

2007年faber小組［19］又把該方法應(yīng)用于大鼠的脊髓中。圖12［20］(b)為用該方法從圖12(a)所示的4×4×25mm3體素中采得的活體大鼠脊髓的HOMOGENIZED譜，可以分辨出大鼠脊髓的主要代謝物。

圖12 活體大鼠脊髓的HOMOGENIZED譜

2.3 不均勻場(chǎng)下分子間單量子相干高分辨譜技術(shù)及其應(yīng)用

2010年陳忠小組把分子間單量子相干 (intermolecular Single－Quantum Coherence，iSQC)信號(hào)應(yīng)用到不均勻場(chǎng)中獲得高分辨的NMR譜，［21］提出了新脈沖序列 (如圖13)。該序列所得譜的表觀J耦合常數(shù)和常規(guī)單量子相干(Single－Quantum Co-herence，SQC)譜的一致，而且新序列能很好地壓制水峰，采樣效率高并對(duì)脈沖角度的不準(zhǔn)確性不敏感。

圖13 基于iSQC的脈沖序列

圖14a為豬腦組織和黃瓜樣品的傳統(tǒng)1D SQC譜，由于線寬為80Hz的不均勻場(chǎng)和強(qiáng)大的水峰信號(hào)不能分辨出任何有用的譜圖信息，而b、c、d IDEAL－III的定域譜中不均勻線寬大大減小而且水峰也得到了有效壓制。與非定域的豬腦組織［21］和黃瓜組織(圖14e)的IDEAL－III譜圖相比，在定域譜中也觀測(cè)到了豬腦組織和黃瓜組織的主要代謝物譜峰。這說(shuō)明IDEAL－III序列也能用于活體高分辨率定域譜。而且與常規(guī)PRESS譜(圖14f－h(huán))相比，其(圖14b－d)能提供更多的譜圖信息?？棇?duì)應(yīng)的IDEAL－III投影譜;(f－h(huán))分別為 (b－d)中所對(duì)應(yīng)定域區(qū)域的常規(guī)PRESS譜;右上方為該樣品的自旋回波成像，黃瓜和豬腦組織的區(qū)域分別標(biāo)為I和II。

圖14 豬腦組織和黃瓜組織的1H MRS

該方法已應(yīng)用于豬腦和黃瓜樣品獲得了高分辨率的體外MRS。2012陳忠小組又把圖13(b)所示的空間定域方法應(yīng)用于活體成年SD大鼠 (Sprague － Dawley rat，SD 大鼠)上，［22］并獲得了高分辨率的NMR譜，這里不再詳細(xì)介紹。

定域iSQC MRS在大體素中對(duì)場(chǎng)的不均性不敏感，所得譜的分辨率可與傳統(tǒng)PRESS從均勻的小體素中得到譜的分辨率相比較。為相對(duì)大的體素，特別是活體研究，提供了一種獲得高分辨率NMR譜的可選方法?？傊诨铙w和體外組織樣品中IDEAL－III序列都具有一定的應(yīng)用前景。

2.4 不均勻場(chǎng)下分子間雙量子相干高分辨技術(shù)及其在人體小腦中的應(yīng)用

與iZQC信號(hào)相比，獲得純的分子間雙量子相干 (intermolecular Double－Quantum Coherence，iDQC)信號(hào)不需要額外的相位循環(huán)，而且iDQC信號(hào)強(qiáng)度比iZQC大約強(qiáng)30%。［23］2010年陳忠小組首次研究了在3T全身成像儀上獲得活體高分辨定域iDQC譜的可行性，［24］圖15為所采用的脈沖序列。

圖15 帶有PRESS定域模塊的用于采集2D iDQC MRS的脈沖序列

Sinc脈沖用于體素選擇、信號(hào)激發(fā)和重聚。高斯形脈沖選擇性激發(fā)水峰?；疑匦?破壞梯度;黒色矩形:片選梯度;斜線矩形:iDQC的相干選擇梯度。

圖16(b)為從20×20×20mm3的體素上獲得的傳統(tǒng)PRESS譜 (體素位置如圖16a)，由于該體素位于右小腦的中心，磁場(chǎng)相對(duì)均勻，可以清楚的分辨出3個(gè)主要的代謝物譜峰。圖16c為用于iDQC采樣的體素，大小為40×40×80mm3覆蓋了整個(gè)左右小腦，不僅包含了小腦組織，還包含了腦脊液和部分腦蓋骨。圖16d為與c相對(duì)應(yīng)的高分辨率1D iDQC投影譜，與b具有類似的分辨率，NAA的線寬大約為6.0Hz。總實(shí)驗(yàn)時(shí)間約為6.5min，是臨床上可以接受的時(shí)間范疇。這表明iDQC方法可以在不均勻場(chǎng)中獲得高分辨率的活體譜圖，而在這種情況下常規(guī)MRS技術(shù)并不適用。此外，腦模型和志愿者小腦的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［24］均已表明在3－T臨床成像儀上 MRS的研究中，可用iDQC信號(hào)在不均勻場(chǎng)中量化代謝物信號(hào)的比率，而且是一種比較可靠的方法。

圖16 人體小腦的MRS

iDQC方法的優(yōu)勢(shì)在于其對(duì)不均勻場(chǎng)不敏感而且采樣效率高，可以在數(shù)分鐘內(nèi)獲得MRS。而且其從不均勻場(chǎng)大體素中獲得的譜圖和PRESS從均勻的小體素中獲得的譜圖分辨率類似。但iDQC譜的J耦合調(diào)制因子為3，對(duì)測(cè)量弱耦合自旋體系中的小J耦合常數(shù)有利，但會(huì)加劇強(qiáng)耦合體系中的譜峰重疊。在傳統(tǒng)方法不適用的較大不均勻場(chǎng)下，iDQC方法是一個(gè)很好地補(bǔ)充。iDQC方法也許可以在不均勻的大體積腦組織中獲得高分辨率的譜圖，并對(duì)代謝物進(jìn)行量化，提供某些疾病的代謝物標(biāo)志物。

3 結(jié)束語(yǔ)

高分辨率的NMR譜技術(shù)能夠?yàn)榉肿咏Y(jié)構(gòu)以及成分分析提供準(zhǔn)確的化學(xué)位移、J耦合以及耦合裂分結(jié)構(gòu)信息。但在很多情況下由于場(chǎng)的不均勻性，無(wú)法得到高分辨率的譜圖。源于遠(yuǎn)程偶極相互作用的iMQC方法對(duì)磁場(chǎng)的不均勻性不敏感，可以在不均勻場(chǎng)下獲得高分辨率的NMR譜。文章總結(jié)了多種iMQC方法并給出了它們?cè)谏锝M織或活體中的應(yīng)用實(shí)例。而且把iMQC方法和定域模塊相結(jié)合在不均勻場(chǎng)下獲得高分辨率的NMR譜。但是這些iMQC信號(hào)都是源于分子間的信號(hào)，其信號(hào)強(qiáng)度比傳統(tǒng)的NMR譜信號(hào)弱。因此iMQC方法得到的高分辨率譜，SNR都比較低，可以說(shuō)這些方法就是犧牲了SNR來(lái)提高譜圖的分辨率。因此如何來(lái)提高iMQC譜的SNR具有重要意義，目前已經(jīng)有研究小組把超極化技術(shù)［25］應(yīng)用于iMQC的研究，或許這種方法能夠用于iMQC譜來(lái)提高譜圖的SNR。

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