張延紅,高素芳
(甘肅中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系,甘肅 蘭州 730000)
黨參ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化△
張延紅*,高素芳
(甘肅中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系,甘肅 蘭州 730000)
目的建立黨參的ISSR-PCR反應(yīng)體系,為今后利用ISSR標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行黨參鑒定及種質(zhì)遺傳多樣性分析提供一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化程序。方法采用試劑盒法提取黨參基因組DNA為模板,通過單因素實(shí)驗(yàn)分析了ISSR-PCR反應(yīng)體系中MgCl2、dNTPs、引物濃度、TaqDNA聚合酶、模板DNA用量及退火溫度對ISSR-PCR擴(kuò)增的影響。結(jié)果建立了重復(fù)性好,分辨率高的ISSR-PCR反應(yīng)體系,即在25μL反應(yīng)體系中,含有10×PCR Buffer緩沖液2.5 μL,MgCl22.0 mmol·L-1,dNTPs 0.5 mmol·L-1,引物0.4 μmol·L-1,Taq DNA聚合酶1.0 U,模板DNA為30 ng;擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min,然后94 ℃變性30 s,51.7 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,共計(jì)35個(gè)循環(huán),循環(huán)結(jié)束后在72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。結(jié)論建立了適用于黨參的ISSR-PCR反應(yīng)體系,為應(yīng)用ISSR技術(shù)鑒定黨參種質(zhì)資源、分子標(biāo)記輔助選擇育種及其遺傳多樣性研究奠定了基礎(chǔ)。
黨參;ISSR-PCR;反應(yīng)體系;優(yōu)化
黨參為桔梗科植物黨參CodonopsisPilosula(Franch.)Nannnf.的干燥根,為我國大宗、常用藥材,也是甘肅道地藥材之一,是中國常用的傳統(tǒng)補(bǔ)益用藥,具有補(bǔ)中益氣、健脾益肺之功效,廣泛用于脾肺虛弱、氣短心悸、食少便溏、虛弱咳嗽等癥[1]。近年來野生黨參資源已十分稀少,個(gè)體間的距離也較遠(yuǎn)[2],因此,建立黨參ISSR-PCR反應(yīng)體系,進(jìn)一步研究該物種的遺傳多樣性是一項(xiàng)十分必要的工作。
ISSR分子標(biāo)記因具有操作簡單、快速高效、遺傳多態(tài)性高、重復(fù)性好等特點(diǎn),近年來已廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定,種質(zhì)資源和遺傳多樣性的研究等方面。ISSR-PCR體系的專屬性比較強(qiáng),不同種植物,其反應(yīng)體系有一定的差異,只有在最佳的條件下,才能獲得穩(wěn)定清晰的多態(tài)性條帶[3-4]。本試驗(yàn)探討了影響ISSR-PCR反應(yīng)的多個(gè)因素,建立了黨參ISSR-PCR反應(yīng)體系,為進(jìn)行黨參種群間遺傳分化的研究奠定基礎(chǔ)。
1.1 材料
試驗(yàn)所用黨參種苗于2011年10月采自甘肅定西渭源縣,以休眠芽為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng),以試管苗的幼嫩莖葉作試材。
1.2 試劑
新型植物基因組DNA快速提取試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司),10×PCR Buffer、Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶(科昊生物工程有限責(zé)任公司),ISSR引物(南京金斯瑞生物科技有限公司)。
1.3 儀器
DYY-7型轉(zhuǎn)移電泳儀,DYCP-32型電泳槽,GelDox XR凝膠成像儀,Biometra-Tgradient PCR梯度擴(kuò)增儀。
2.1 基因組DNA的提取及檢測
用試劑盒法并略做修改提取DNA:(1)在1.5 μL離心管中加入450 μL溶液A,然后加入β-巰基乙醇2.26 μL;(2)取樣品70 mg,在研缽中加入液氮充分研磨成粉末狀;(3)將研磨好的粉末加到以上預(yù)備好的溶液A中,65 ℃水浴25 min,期間顛倒混勻樣品5次,(4)除RNA:水浴完后,加入10 μL RNase混勻,25 ℃下靜置10 min;(5)加入400 μL溶液B,充分混勻,常溫靜置5 min;12 000 rpm離心5 min;(6)除蛋白:加入500 μL氯仿,12 000 rpm離心5 min;(7)小心將上清轉(zhuǎn)到一個(gè)新的離心管中(勿將沉淀吸入),加入600 μL異丙醇,充分混勻,室溫放置10 min;(8)12 000 rpm離心10 min,小心去上清(勿將DNA樣品的沉淀倒出);(9)加入600 μL溶液C,顛倒混勻倆次,12 000 rpm離心5 min,棄廢液;(10)重復(fù)步驟(9)一次;(11)于室溫敞蓋放置,至無明顯乙醇味;(12)加入130 μL溶液D,離心管中即為基因組DNA溶液。在0.7%(M/V)瓊脂糖凝膠中電泳后成像,檢測提取的DNA質(zhì)量,將質(zhì)量好的于-20 ℃保存以備用。
2.2 ISSR-PCR反應(yīng)的初始條件及程序
黨參ISSR-PCR體系的建立參考其它幾種藥用植物的ISSR-PCR反應(yīng)體系[5-7],確定初步的反應(yīng)體系為:總體積25 μL,內(nèi)含2.5 μL 10xPCR buffer,MgCl22.0 mmol·L-1,dNTPS 0.5 mmol·L-1,Primers 0.5 μmol·L-1,Taq DNA聚合酶0.5 U,模板DNA為30 ng。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min,然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán):94 ℃變性30 s,53.7 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。
2.3 退火溫度的確定
利用梯度PCR模式,設(shè)定退火溫度最低48.0 ℃,和最高58.0 ℃,擴(kuò)增儀自動生成10個(gè)溫度梯度:48.5、48.7、49.4、50.5、51.7、52.9、54.1、55.3、56.4、57.5 ℃;其余PCR擴(kuò)增程序同2.2項(xiàng)下,以確定最佳退火溫度。
2.4 ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化
黨參ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化采用單因素試驗(yàn),逐步確定體系中每個(gè)因素的最佳反應(yīng)參數(shù)。MgCl2設(shè)以下5個(gè)濃度:1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol·L-1;dNTPs設(shè)以下5個(gè)濃度:0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol·L-1;引物(845)濃度設(shè)以下5個(gè)濃度:0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol·L-1;Taq DNA聚合酶設(shè)以下5個(gè)濃度0.5、1.0、1.5、2.0、2.5U;DNA模板的用量設(shè)以下5個(gè):30、35、40、45、50 ng。
2.5 ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定
取擴(kuò)增產(chǎn)物6 μL和上樣緩沖液1 μL混勻后點(diǎn)樣,在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳分離,以0.5xTBE為緩沖液,穩(wěn)壓100V,電泳至凝膠的2/3處結(jié)束。采用EB染色法染色20 min,在凝膠成像系統(tǒng)上照相。
3.1 黨參試管苗基因組DNA的提取
本試驗(yàn)提取的DNA為無色沉淀,如圖1,各泳道點(diǎn)樣孔比較干凈,DNA條帶無拖尾,表明該方法所提的DNA質(zhì)量較好,可用于ISSR-PCR體系優(yōu)化的模板。
M:DNA marker 1~4為提取的基因組DNA 圖1 黨參基因組DNA的電泳結(jié)果
3.2 退火溫度對ISSR擴(kuò)增的影響
退火溫度明顯影響ISSR-PCR反應(yīng)的進(jìn)行,不同引物的退火溫度通常也不一樣,以845為引物,進(jìn)行退火溫度梯度試驗(yàn),由PCR梯度擴(kuò)增儀自動生成10個(gè)溫度,確定了引物845以黨參基因組DNA為模板擴(kuò)增的最佳退火溫度。由圖2可知,退火溫度為48.5、48.7 ℃時(shí),背景有點(diǎn)模糊;溫度為49.4、50.5、51.7 ℃時(shí),條帶清晰,亮度適宜;溫度為52.9 ℃時(shí),條帶減少;溫度為54.1、55.3 ℃時(shí),條帶之間界限不太明顯;溫度為56.4、57.5 ℃時(shí),條帶減少,模糊不清。因此,退火溫度過高或過低都不利于產(chǎn)物擴(kuò)增,在允許的范圍內(nèi),選擇較高的退火溫度可減少引物與模板之間的非特異性結(jié)合,提高反應(yīng)的特異性,因此,引物845的最佳退火溫度為51.7 ℃,以下試驗(yàn)均采用51.7 ℃的退火溫度。然后在這一條件下,研究ISSR-PCR反應(yīng)中其他因素對擴(kuò)增效果的影響,從中選擇確定最優(yōu)的反應(yīng)條件。
M:DNA marker 1~10溫度為48.5、48.7、49.4、50.5、 51.7、52.9、54.1、55.3、56.4、57.5 ℃ 圖2 退火溫度對ISSR擴(kuò)增的影響
3.3 MgCl2濃度對ISSR擴(kuò)增的影響
MgCl2濃度對ISSR-PCR反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增效率均有較大的影響,在反應(yīng)體系中MgCl2濃度過低,會顯著降低酶的活性,而MgCl2濃度過高時(shí),又使酶催化非特異性擴(kuò)增增強(qiáng),試驗(yàn)設(shè)5個(gè)MgCl2濃度梯度進(jìn)行篩選,如圖3所示,MgCl2濃度為1.5 mmol·L-1時(shí),擴(kuò)增的條帶較少;MgCl2濃度為2.0 mmol·L-1時(shí),能得到清晰穩(wěn)定的條帶;MgCl2濃度為2.5~3.0 mmol·L-1時(shí),擴(kuò)增的產(chǎn)物只有個(gè)別幾條帶,而且模糊不清;MgCl2濃度為3.5 mmol·L-1時(shí),條帶較暗。因此,選擇2.0 mmol·L-1MgCl2作為黨參ISSR-PCR反應(yīng)體系的最佳濃度。
M:DNA marker 1~5 MgCl2濃度分別為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol·L-1圖3 MgCl2濃度對ISSR擴(kuò)增的影響
3.4 dNTPs濃度對ISSR擴(kuò)增的影響
適宜的dNTPs對于獲得理想的ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物尤為重要,如圖4所示,當(dāng)dNTPs濃度為0.1~0.2 mmol·L-1時(shí),擴(kuò)增條帶少且較弱;在0.3~0.5 mmol·L-1時(shí),條帶多而清晰,多態(tài)性好,相對而言0.5 mmol·L-1更清晰些;所以本試驗(yàn)選擇0.5 mmol·L-1的dNTPs濃度作為黨參ISSR反應(yīng)體系的最佳濃度。
3.5 引物濃度對ISSR擴(kuò)增的影響
引物濃度對PCR擴(kuò)增的帶型有明顯的影響,濃度過低會導(dǎo)致ISSR-PCR產(chǎn)物量降低;而引物量過高,則會引起堿基錯(cuò)配和非特異性的擴(kuò)增,生成引物二聚體,從而使目的DNA片段的擴(kuò)增量下降。如圖5所示,當(dāng)引物濃度為0.1 μmol·L-1時(shí)的擴(kuò)增條帶最少;當(dāng)引物濃度為0.2~0.3 μmol·L-1時(shí),擴(kuò)增條帶較少,而且條帶不清晰;濃度為0.4~0.5 μmol·L-1時(shí),條帶多而清晰,相對而言以0.4 μmol·L-1的條帶最清晰明亮;因此,選擇0.4 μmol·L-1的引物濃度作為黨參ISSR-PCR反應(yīng)體系的最佳濃度。
M:DNA marker 1~5 dNTPs濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol·L-1圖4 dNTPs濃度對ISSR擴(kuò)增的影響
M:DNA marker 1~5引物濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmmol·L-1圖5 引物濃度對ISSR擴(kuò)增的影響
3.6 Taq DNA聚合酶對ISSR擴(kuò)增的影響
Taq DNA聚合酶在ISSR-PCR體系中的加入量也很重要,若量過少會影響靶序列擴(kuò)增產(chǎn)量,而過多則會導(dǎo)致非特異性的擴(kuò)增;如圖6所示,Taq DNA聚合酶用量為0.5 U時(shí)擴(kuò)增條帶少而不清晰;Taq DNA聚合酶用量在1.0 U的條帶背景較1.5~2.5 U的清晰,1U時(shí)的擴(kuò)增條帶明顯,反應(yīng)穩(wěn)定;因此,選擇1.0 U的Taq DNA聚合酶濃度作為黨參ISSR-PCR反應(yīng)體系的最佳濃度。
3.7 模板DNA的用量對ISSR擴(kuò)增的影響
模板DNA用量對ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和穩(wěn)定性影響不大,如圖7所示,本試驗(yàn)提取的DNA用量為30~50 ng的范圍內(nèi),均可擴(kuò)增出條帶清晰的產(chǎn)物,因此30~50 ng的DNA模板均適合黨參基因組DNA PCR反應(yīng)的用量,相對而言,DNA用量30 ng時(shí)擴(kuò)增條帶較明顯,因此本試驗(yàn)選擇DNA用量為30 ng作為黨參ISSR-PCR反應(yīng)體系的最佳濃度。
M:DNA marker 1~5 Taq DNA聚合酶濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 U 圖6 Taq DNA聚合酶對ISSR擴(kuò)增的影響
M:DNA marker 1~5 模板DNA的用量分別為30、35、40、45、50 ng 圖7 模板DNA的用量對ISSR擴(kuò)增的影響
4.1本試驗(yàn)以黨參基因組DNA為材料,建立了分辨率高、可靠性好的黨參ISSR-PCR反應(yīng)體系,即在25 μL反應(yīng)體系中,含有10×PCR Buffer緩沖液2.5 μL,MgCl22.0 mmol·L-1,dNTPs 0.5 mmol·L-1,引物0.4μ mol·L-1,Taq DNA聚合酶1.0 U,模板DNA為30 ng;通過梯度退火得到引物845的最佳退火溫度為51.7 ℃;擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min,然后94 ℃變性30 s,51.7 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,共計(jì)35個(gè)循環(huán),循環(huán)結(jié)束后在72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。得到了清晰,多態(tài)性高的ISSR譜帶,為ISSR-PCR在黨參的分類鑒定和育種學(xué)研究中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
4.2ISSR分子標(biāo)記技術(shù)基于PCR反應(yīng),它具有以下優(yōu)點(diǎn):不需要事先知道靶序列;由于較高的退火溫度和更長的引物序列,可產(chǎn)生重復(fù)性好的擴(kuò)增帶;模板需要量少,多態(tài)性豐富,結(jié)果記錄方便。目前已廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定,遺傳圖譜和遺傳多樣性等方面的研究。但影響ISSR擴(kuò)增結(jié)果的因素較多,各因素的變化會不同程度地影響到帶譜的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性[8],因此,有必要對其影響因子進(jìn)行篩選和優(yōu)化,確立最適宜的ISSR反應(yīng)體系。退火溫度對擴(kuò)增條帶的清晰程度和條帶數(shù)目有明顯影響。引物的堿基構(gòu)成不同,適宜的退火溫度就可能不同,因此,只有針對不同的引物進(jìn)行相應(yīng)的退火溫度設(shè)計(jì)、優(yōu)化,才能獲得清晰、穩(wěn)定的擴(kuò)增帶。模板濃度在30~50 ng之間擴(kuò)增結(jié)果相同,紅松ISSR-PCR實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)影響因素研究一文中發(fā)現(xiàn)模板濃度在10~200 ng之間擴(kuò)增結(jié)果相同[9],說明ISSR-PCR對模板濃度的要求范圍較寬,具有較好的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。
[1] 周秀佳,徐宏發(fā),順慶生.中藥資源[M].上海:上??茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社,2007.
[2] 王崢濤,徐國鈞.中藥黨參的藥源調(diào)查[J].醫(yī)學(xué)教育探索,1992,(3):144-147.
[3] 王延華,Pierre Dubus.PCR理論與技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社,2009.
[4] 李海生.ISSR分子標(biāo)記技術(shù)及其在植物遺傳多樣性分析中的應(yīng)用[J].生物學(xué)通報(bào),2004,39(2):19-21.
[5] 邱英雄,傅承新,吳斐捷.明黨參與川明參群體遺傳結(jié)構(gòu)及分子鑒定的ISSR分析[J].中國中藥雜志,2003,28(7):598-603.
[6] 隋春,魏建和,陳士林,等.柴胡ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2008,19(8):1837-1839.
[7] 郭丁丁,馬逾英,唐琳,等.白芷ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2008,31(2):45-48.
[8] 鄧婧,陳新.黃花蒿ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2006,29(3):51-53.
[9] 馮富娟,王鳳有,劉彤.紅松ISSR-PCR實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)影響因素[J].植物學(xué)通報(bào),2004,21(3):326-331.
Establishment and Optimization of ISSR-PCR Reaction System for Codonopsis Pilosula(Franch.)Nannnf.
ZHANG Yanhong*,GAO Sufang
(DepartmentofPharmacy,GansuCollegeofTCM,Lanzhou730000,China)
Objective:The study focused on setting up ISSR-PCR reaction system ofCodonopsispilosula(Franch.)Nannnf.,which will provide a standard procedure for Codonopsis germplasm resources analysis.MethodsDNA ofC.pilosulawas extracted by kit method,and the influence of MgCl2,dNTPs,primer concentration,Taq DNA polymerase,DNA template amount and the annealing temperature on ISSR-PCR amplification were studied by single factor experiment.ResultsThe optimal reaction system for ISSR analysis contains 10×PCR Buffer 2.5 μL,2.0 mmol·L-1MgCl2,0.5 mmol·L-1dNTPs,0.4 μmol·L-1primer,1.0 U Taq DNA polymerase,30 ng template DNA,in 25 μL total reaction volume.Amplification procedure is:94 ℃ initial denaturation 5 min,and then 94 ℃ denaturation 30 s,51.7 ℃ annealing 1 min,72 ℃ extends 1.5 min,total of 35 cycles,after the cycles extension for 7 min at 72 ℃,storing at 4 ℃.ConclusionThe stable and reproducible optimal ISSR-PCR reaction system was established forC.pilosula,which laid a good foundation for germplasm resources identification,molecular marker assisted breeding and genetic diversity study.
Codonopsispilosula(Franch.)Nannnf.;ISSR-PCR;Reaction system;Optimization
“十二五”國家科技支撐計(jì)劃課題(2011BAI05B02)
*
張延紅,副教授,研究方向:藥用植物育種和組織培養(yǎng),Tel:(0931)8765393,E-mail:zhyh456789@163.com
10.13313/j.issn.1673-4890.2014.07.008
2014-02-08)