張輝，劉東，李影，趙好冬，李梅，孫佳明

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，吉林 長(zhǎng)春 130117)

研究開(kāi)發(fā)

國(guó)家自然基金——基于肽鏈熱振蕩理論對(duì)熱炮制珍珠母物質(zhì)基礎(chǔ)與生物活性變化機(jī)理研究(81073048)

*

孫佳明，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)；E-mail:sun_jiaming2000@163.com

珍珠母炮制前后寡肽類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定及對(duì)比分析△

張輝，劉東，李影，趙好冬，李梅，孫佳明*

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，吉林 長(zhǎng)春 130117)

目的對(duì)中藥珍珠母炮制前后寡肽類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定及對(duì)比分析。方法采用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-DAD-ESI-MS/MS)技術(shù)對(duì)珍珠母炮制前后的寡肽類(lèi)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果初步解析了珍珠母生品中4個(gè)寡肽化合物的結(jié)構(gòu)，分別為Op-1(COOH-Lys-Ala-NH2)、Op-2(COOH-Asn-Val-NH2)、Op-3(COOH-Asn-Val-Ala-NH2)和Op-4(COOH-Asn-Val-Ala-Ala-NH2)；而炮制品中不含Op-1，含有其他3個(gè)寡肽Op-2、Op-3和Op-4。結(jié)論本方法可用于珍珠母藥材中寡肽類(lèi)化學(xué)成分的快速分析及結(jié)構(gòu)鑒定，并對(duì)珍珠母炮制前后的藥效物質(zhì)變化規(guī)律及炮制機(jī)理研究提供了科學(xué)依據(jù)。

珍珠母；寡肽；炮制；高效液相色譜；電噴霧質(zhì)譜

珍珠母為蚌科動(dòng)物三角帆蚌Hyriopsiscumingii(Lea)、褶紋冠蚌Cristariaplicata(Leach)或珍珠貝科動(dòng)物馬氏珍珠貝Pteriamartensii(Dunker)的貝殼，為我國(guó)傳統(tǒng)中藥,收載于歷版《中國(guó)藥典》，具有平肝潛陽(yáng)，安神定驚，明目退翳的作用，用于頭痛眩暈，驚悸失眠，目赤翳障，視物昏花[1]。其主產(chǎn)于江蘇、浙江、河北、安徽等地，多數(shù)集中在江蘇蘇州，加工制成紐扣，剩余殘料銷(xiāo)往全國(guó)各地，作珍珠母入藥。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)珍珠母中的化學(xué)成分進(jìn)行了大量研究，表明珍珠母中含有碳酸鈣、硬蛋白、氨基酸、微量元素等多種化合物，并發(fā)現(xiàn)它們具有抗氧化、利尿、抑制腸管和子宮收縮等作用。目前，關(guān)于珍珠母的文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在對(duì)珍珠母的氨基酸、微量元素等含量測(cè)定[2-4]和抗氧化活性研究[5]上，而應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)珍珠母中寡肽類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定，尤其是對(duì)珍珠母炮制前后寡肽類(lèi)化合物的對(duì)比分析尚未見(jiàn)報(bào)道。近年來(lái)，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在中藥的快速分析分離及結(jié)構(gòu)鑒定方面顯示出越來(lái)越重要的作用[6-7]。本文對(duì)珍珠母及其炮制品中寡肽類(lèi)化合物一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了對(duì)比分析研究。

1 材料與儀器

1.1 材料

珍珠母采于吉林省嫩江畔月亮湖，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)張輝教授鑒定為蚌科動(dòng)物三角帆蚌Hyriopsiscumingii(Lea)的貝殼。

1.2 儀器

BS110S電子天平(德國(guó)賽多利斯股份公司)；FD-1000凍干機(jī)(東京理化株式會(huì)社)；電熱恒溫水浴鍋(北京國(guó)華醫(yī)療器械廠)；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)；CR20B2 型冷凍高速離心機(jī)(日本日立)；閃式蒸發(fā)濃縮系統(tǒng)(長(zhǎng)春康彼達(dá)科技有限公司)；Agilent 1100HPLC，Agilent 6350 ESI-MS/MS(美國(guó)Agilent公司)。

2 方法

2.1 樣品的制備

珍珠母生品：將晾干的珍珠母粉碎過(guò)40～60目篩。

珍珠母炮制品：將珍珠母生品于150 ℃烘箱中烘烤1 h，取出，晾涼即得。

珍珠母生品總寡肽：取珍珠母生品1 kg，加蒸餾水3 L，加熱回流提取2次，每次2 h，濾過(guò)，合并濾液，閃蒸濃縮后，凍干，取珍珠母生品凍干粉粉末5 mg，加水1 mL溶解，過(guò)0.45 μm膜，供液質(zhì)聯(lián)用分析。

珍珠母炮制品總寡肽：依珍珠母生品總寡肽的制備方法制得。

2.2 色譜條件

Venusil ASB-C18色譜柱(150 A，250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為1‰甲酸乙腈(A)，1‰甲酸水溶液(B)，進(jìn)樣量為10 μL，流速為0.3 mL·min-1，柱溫為30 ℃，洗脫時(shí)間為20 min，按A-B(1∶99)等度洗脫。

2.3 質(zhì)譜條件

電離源：電噴霧離子源(ESI)，檢測(cè)方式：正離子檢測(cè)，掃描范圍：m/z 50～1 200，干燥氣溫度：350 ℃，干燥氣流量：11.0 L·min-1，霧化氣壓強(qiáng)：45.0 psi，毛細(xì)管電壓：4 kV。

3 結(jié)果

取珍珠母生品和炮制品總寡肽按上述色譜條件和質(zhì)譜條件應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用儀分析，得到二者的總離子流圖及各肽的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖。對(duì)珍珠母生品和炮制品總寡肽總離子流圖的色譜峰進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)其生品和炮制品中都有準(zhǔn)分子離子為m/z 232、303和374的寡肽類(lèi)化合物，但炮制品中一個(gè)準(zhǔn)分子離子為218的二肽消失，以上4個(gè)寡肽類(lèi)化合物依照出峰時(shí)間命名為Op-1、Op-2、Op-3和Op-4，二者總離子流圖如圖1所示。

A.生品 B.炮制品1.Op-1 2.Op-2 3.Op-3 4.Op-4圖1 珍珠母生品和炮制品總寡肽的總離子流圖

電噴霧質(zhì)譜是一種軟電離技術(shù)，在正離子模式下，經(jīng)常同時(shí)出現(xiàn)[M+H]+、[M+Na]+、[2M+H]+、[2M+Na]+等一系列準(zhǔn)分子離子峰，但寡肽類(lèi)成分的準(zhǔn)分子離子峰一般為[M+H]+[8]。根據(jù)珍珠母生品和炮制品總寡肽準(zhǔn)離子峰可以確定各化合物的分子量信息，通過(guò)碰撞誘導(dǎo)解離(CID)使目標(biāo)化合物碎裂成碎片離子，從而可進(jìn)一步獲得各寡肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)信息。例如生品和炮制品總寡肽中共有的Op-2準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z為232，說(shuō)明其分子量為231，氨基酸的平均分子量為128，根據(jù)氮律分子應(yīng)含偶數(shù)個(gè)氮，推斷峰2可能為二肽化合物；在碰撞誘導(dǎo)解離過(guò)程中，m/z 232離子失去一分子水(18Da)生成m/z 214離子；m/z 232離子失去一分子纈氨酸(117Da)生成m/z 115離子；m/z 115為天冬酰胺脫去水加氫而生成的離子。結(jié)合寡肽類(lèi)裂解規(guī)律，推知Op-2由纈氨酸和天冬酰胺兩個(gè)氨基酸脫水形成酰胺鍵后生成的二肽，其一級(jí)結(jié)構(gòu)為COOH-Asn-Val-NH2。珍珠母生品和炮制品總寡肽的HPLC-DAD-ESI-MS/MS分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 珍珠母生品和炮制品總寡肽正離子掃描模式的HPLC-DAD-ESI-MS/MS分析結(jié)果

注：+表示含有寡肽化合物，—表示不含有寡肽化合物。

4 討論

通過(guò)對(duì)珍珠母生品總離子流圖的分析，結(jié)合寡肽化合物的裂解規(guī)律，對(duì)珍珠母生品中的寡肽化合物進(jìn)行分析及結(jié)構(gòu)鑒定，推斷出Op-1、Op-2、Op-3和Op-4的一級(jí)結(jié)構(gòu)，說(shuō)明珍珠母中含有寡肽化合物。通過(guò)生品與炮制品的總離子流圖的對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)珍珠母經(jīng)過(guò)炮制后仍然含有寡肽化合物，二者都含有分子量為231、302和373的寡肽化合物，而炮制品中一個(gè)分子量為217的二肽消失，可能是在炮制時(shí)因溫度過(guò)高而使肽鍵斷裂，二肽消失。從傳統(tǒng)炮制經(jīng)驗(yàn)可知，珍珠母經(jīng)炮制后易于煎煮并提高療效，這可能與現(xiàn)代熱振蕩理論中蛋白、肽類(lèi)成分中肽鍵經(jīng)熱振蕩發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致了活性發(fā)生相應(yīng)的改變有關(guān)，這為探討傳統(tǒng)中藥炮制理論提供了科學(xué)的證據(jù)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：216.

[2] 鐵步榮,云秦川.中藥珍珠母中碳酸鈣的含量測(cè)定[J].中國(guó)海洋藥物，1991，(2)：28-30.

[3] 李桂萍.不同品種珍珠母中氨基酸的含量測(cè)定[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，17(1)：60-62.

[4] 李軒貞,成立華.珍珠母中微量元素的研究[J].中國(guó)海洋藥物，1990，(3)：5-7.

[5] 龍盛京，岑立燁，覃愛(ài)娟，等.馬氏珍珠母貝提取液抗氧自由基作用的研究[J].中國(guó)生化藥物雜志，1999，20(1)：41-43.

[6] 劉榮霞，果德安，葉敏，等.液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC/MS)在中藥現(xiàn)代研究中的應(yīng)用[J].世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2005，7(5)：33-40.

[7] Cai ZW，Lee FSC，Wang XR.A capsule review of recent studies on the application of mass spectrometry in the analysis of Chinese medicinal herds[J].Journal of Mass Spectrometry，2002，37：1013-1024.

[8] 王賢純，陳平，梁宋平.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析化學(xué)合成多肽及其主要副產(chǎn)物[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，2003，19(5)：576-581.

AnalysisofOligopeptidesinMargaritiferaconchaandProcessedMargaritiferaconchabyHPLC-DAD-ESI-MS/MS

ZHANGHui,LIUDong,LIYing,ZHAOHaodong,LIMei,SUNJiaming*

(DevelopmentCenterofTraditionalChineseMedicineandBioengineering,ChangchunUniversityofTraditionalChineseMedicine,Changchun130117,China)

Objective：Comparison of the structures of oligopeptides inMargaritiferaconchaand processedMargaritiferaconcha.MethodsAnalysis of oligopeptides inMargaritiferaconchaand processedMargaritiferaconchaby HPLC-DAD-ESI-MS/MS.ResultsFour oligopeptides fromMargaritiferaconchawere identified,which are Op-1(COOH-Lys-Ala-NH2)、Op-2(COOH-Asn-Val-NH2)、Op-3(COOH-Asn-Val-Ala-NH2)and Op-4(COOH-Asn-Val-Ala-Ala-NH2)respectively.There were Op-2,Op-3 and Op-4 in processedMargaritiferaconcha.,except Op-1.ConclusionThe method could be used to analyze the structures of oligopeptides inMargaritiferaconchaand processedMargaritiferaconchaquickly.Furthermore,it provides a scientific basis for these active components change rules and the process mechanism ofMargaritiferaconchain preparation process.

Margaritiferaconcha;Oligopeptide;Preparation;HPLC;ESI-MS

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.04.005

2013-11-23)