畢武，周佳民，黃艷寧，曹亮，朱校奇

(湖南省農業(yè)科學院 農業(yè)生物資源利用研究所，湖南 長沙 410125)

國家公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201303117)，長沙藥用植物特色產業(yè)科技示范基地(K1303011-21)

△*

朱校奇，研究員，研究方向：藥用植物栽培，Tel：(0731)84692900，E-mail：zhuxiaoqi222@163.com

湖南地區(qū)玉竹根腐病病原鑒定及其生物學特性研究△

畢武，周佳民，黃艷寧，曹亮，朱校奇*

(湖南省農業(yè)科學院 農業(yè)生物資源利用研究所，湖南 長沙 410125)

目的明確導致湖南地區(qū)玉竹根腐病發(fā)生的主要病原。方法通過調查湖南玉竹主產區(qū)玉竹根腐病發(fā)生情況，對病原進行分離，并采用柯赫氏法則進行致病性測定，最后根據真菌形態(tài)和分子鑒定結果確定病原菌種屬，同時對該病原菌基本的生物學特性進行了測定。結果芬芳鐮刀菌Fusariumredolens為玉竹根腐病主要病原，該菌菌絲生長適宜碳源為蔗糖，氮源為牛肉膏，溫度為25 ℃左右，pH為8～9。結論本研究明確了湖南玉竹主產區(qū)玉竹根腐病病原及其基本的生物學特性，不但為該病害的防控提供了依據，還可為抗病育種奠定基礎。

玉竹；根腐病；病原；芬芳鐮刀菌；生物學特性

玉竹Polygonatumodoratum(Mill.)Druce為百合科Liliaceae黃精屬Polygonatum植物，以根狀莖藥用，為常用中藥，《神農本草經》、《本草正義》均有記載，該藥在中國已有幾千年的用藥歷史[1-2]。玉竹又名葳蕤、萎蕤、女萎。性味歸經：甘，微寒，入肺、胃經。功能與主治：養(yǎng)陰潤燥，生津止渴。用于肺胃傷陰、燥熱咳嗽、咽干口渴，內熱消渴[3]。

目前，玉竹在中國大部分地區(qū)均有分布，人工栽培玉竹主要產于湖南邵東、廣東連縣、江蘇南通、浙江東陽等19個縣/市。以湖南邵東產量大、質量好，絕大部分出口外銷，稱“湘玉竹”[4]。

近年來，隨著玉竹種植規(guī)模的逐漸擴大、種植年限的增加，全國大部分玉竹產地病蟲害也越來越重，已嚴重影響玉竹的品質，成為玉竹生產開發(fā)的主要障礙。在邵東地區(qū)，近年來連年連片種植，行間蔭蔽，導致病菌的發(fā)生與流行，尤其是引起根部染病的土傳病害，逐年加重，嚴重影響了玉竹的產量和品質。

因此，明確玉竹根腐病的病原就顯得十分迫切和必要，在此基礎上了解其相關生物學特性，可為科學合理的病害防治奠定良好基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2012年5～8月間于湖南省邵東斫曹鄉(xiāng)玉竹種植地采集發(fā)病的典型樣本20株。

1.2 真菌分離

采用常規(guī)組織分離法進行真菌分離，分離到的菌株經單孢純化后接種在PDA斜面上[5-6]，4 ℃冰箱中保存。

1.3 真菌的形態(tài)鑒定

對采集的標本描述其癥狀，顯微鏡下觀察病原菌的形態(tài)特征，測定50個孢子的大小。根據癥狀特點、真菌的形態(tài)、大小，參照有關資料進行鑒定[7-8]。如系鐮孢菌，在Booth標準條件下培養(yǎng)。根據培養(yǎng)菌的形態(tài)特征進行鑒定。

1.4 真菌的分子鑒定

1.4.1 DNA提取 將所保存的待測菌株接種到PDA平板上活化，25 ℃下培養(yǎng)7 d后刮取少量菌絲，液氮研磨，然后按DNA提取試劑盒(北京博邁德科技發(fā)展有限公司)上的操作說明書進行DNA提取，最后將提取出來的DNA置于-20 ℃保存。

1.4.2 擴增引物 rDNA ITS區(qū)采用通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和 ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAGG-3′)進行PCR擴增[9]；翻譯延伸因子TEF-1α區(qū)采用通用引物EF1T(5′-ATGGGAAGGAGGACAAGAC-3′)和EF2T(5′-GGA-AGTACCAGTGATCATGTT-3′)進行PCR擴增[10]。

1.4.2 PCR反應條件 PCR反應體系為：2×PCR StartMix 15 μL(以上試劑均為北京康潤生物公司生產)，模板DNA 10 ng，引物(10 μmol)各1 μL，加dd H2O使總體積達到30 μL，在PCR擴增儀(Mastercycler nexus gradient，Eppendorf)上進行擴增。擴增條件：95 ℃預變性4 min，94 ℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min[9-10]。PCR產物由北京天一輝遠生物公司進行序列測定。

1.4.3 序列分析與數據處理 測定的rDNA ITS序列和TEF-1α序列通過BLAST軟件與GenBank 核酸數據庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)中的相關序列進行同源性比較。

1.5 致病性測定

根據柯赫氏法則進行測定，采用活體根部接種法結合盆栽接種法[5，10-11]。

活體根部接種法：將所保存的待測菌株接種到PDA平板上活化，25 ℃下培養(yǎng)7 d后，用無菌蒸餾水洗下孢子，并將孢子濃度調整到1×106個/mL。取冬季休眠期健康3年生玉竹完整根莖，用5%NaClO進行表面消毒，無菌水沖洗3次，然后在配好的孢子懸浮液中浸泡5 min，取出放入鋪有2層滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，加入少量無菌水保濕，以無菌水作為對照，每個菌株接種12棵根莖，其中6棵為刺傷接種。25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。接種期間玉竹根莖為活體狀態(tài)。對接種后表現(xiàn)根腐癥狀的根莖進行病原再次分離培養(yǎng)，觀察得到的病菌是否與原接種菌株相同。

盆栽接種法 將所保存的待測菌株接種到PDA平板上活化，25 ℃下培養(yǎng)7d后，接入裝有半盆經過濕熱滅菌土壤的花盆中，拌勻。取冬季休眠期健康3年生玉竹完整根莖，用5%NaClO進行表面消毒，無菌水沖洗3次，栽入花盆中，蓋上一層滅菌土。以不接菌的盆栽作為對照，接種方式分刺傷和不刺傷，每個花盆接種3棵根莖，各4次重復。其中12棵為刺傷接種。室溫條件下培養(yǎng)。對接種后表現(xiàn)病害癥狀的植株進行病原再次分離培養(yǎng)，觀察得到的病菌是否與原接種菌株相同。

1.6 生物學特性測定

將供試菌株在PDA平板上培養(yǎng)5 d后，用內徑為5 mm的打孔器在菌落邊緣切取菌絲圓片并置于不同的條件下培養(yǎng)，分別進行以下處理[12-13]。

1.6.1 不同溫度條件下菌絲生長 采用PDA平板測定。溫度范圍為5～40 ℃，梯度為5 ℃。每處理重復4次。恒溫下培養(yǎng)6 d后測量菌落兩個相互垂直生長直徑，取其平均值。

1.6.2 不同pH條件下菌絲生長 采用PDA平板測定。pH范圍為3.0～11.0，梯度為1.0，每處理重復4次。用1 mol·L-1的HCl或1 mol·L-1的NaOH調節(jié)pH。測定方法與溫度的測定方法相同。

1.6.3 不同碳源條件下菌絲生長 以查氏培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別用不同類型的糖(葡萄糖、蔗糖、甘油、D-麥芽糖、D-果糖、D-半乳糖、乳糖、可溶性淀粉)來等量取代基礎培養(yǎng)基內的碳源后形成供試培養(yǎng)基，每處理重復4 次。6 d后測量菌落生長直徑，取其平均值。

1.6.4 不同氮源條件下菌絲生長 以查氏培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別用NH4+態(tài)氮[NH4Cl、(NH4)4SO4]、NO3-態(tài)氮(KNO3，NH4NO3)和有機氮(甘氨酸、L-苯丙氨酸、L-羥基脯氨酸、牛肉膏、蛋白胨)來等量取代基礎培養(yǎng)基內的氮源后形成供試培養(yǎng)基。測定方法與碳源的測定方法相同。

圖1 菌落

圖2 厚垣孢子(40×)

圖3 產孢結構(40×)

2 結果與分析

2.1真菌形態(tài)學及分子鑒定結果

從玉竹病根上分得真菌73株，對這些真菌的鑒定結果顯示，玉竹病根上真菌主要類群為Fusariumredolens，F(xiàn).oxysporium，F(xiàn).nematophilum，F(xiàn).solani，Rhizopycnisvagum。

2.2 致病性測定結果

對分離得到的真菌進行了致病性測定，根據離體接種結果和盆栽實驗顯示，確定編號為YG1的真菌為玉竹根腐病的主要病原，在兩種測定條件下都能引起玉竹的病害，其中刺傷接種發(fā)病程度更嚴重。

2.3 病原菌鑒定結果

形態(tài)鑒定：培養(yǎng)物在PSA培養(yǎng)基上呈淡黃色，絨毛狀，菌絲體白色。小型分生孢子橢圓形或臘腸形，著生于短的側生瓶狀小梗上，數量多，大小為2-8～1-4 μm。大型分生孢子鐮刀形，傾向于“馬特”型，數量稀少。厚垣孢子間生或頂生，單獨或呈鏈狀，光滑或粗糙。

分子鑒定：根據YG1菌ITS序列和TEF-1α序列比對結果，與該菌ITS序列序列相似度最高的為F.redolens(100%)，F(xiàn).oxysporium(99%)和F.con-centricum(98%)與TEF-1α序列相似度最高的為F.redolens(100%)，兩序列的GenBank登錄號分別為KF055838和KF055839。

綜合形態(tài)鑒定和分子鑒定結果，確定該菌為Fusariumredolens。

2.4 生物學特性測定結果

2.4.1 不同碳源條件下菌絲生長 菌落在所測試碳源(包括單糖，雙糖，多糖)中均能生長，在葡萄糖和蔗糖上生長最好，其中以蔗糖為最佳碳源。

2.4.2 不同氮源條件下菌絲生長 菌落在三種氮源條件下均能生長，其中，在NO3-態(tài)氮和有機氮上生長良好，NH4+態(tài)氮上生長稍差。在以牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基上長勢最佳。

2.4.3 不同pH條件下菌絲生長 菌落在pH 3～11范圍內都能生長，其中以pH 5～10之間生長良好，pH 8～9范圍內為其生長的最適pH。由此可見，該菌在中性和偏堿性的條件生長最好。

圖4 不同碳源下菌絲生長

圖5 不同氮源下菌絲生長

圖6 不同pH條件下菌絲生長

圖7 不同溫度下菌絲生長

2.4.4 不同溫度條件下菌絲生長 菌落在5 ℃和40 ℃均不能生長，25 ℃左右為其生長的最佳溫度。菌落在10～35 ℃都能生長，10～35 ℃范圍內生長直徑隨溫度升高而增大，但溫度過高或過低均對菌絲生長不利。

3 討論

目前僅貴州、遼寧、湖南等玉竹主產地初步報道了玉竹的病害及其防治情況，貴州地區(qū)主要以葉斑病，莖腐病，銹病等真菌性病害為主，但關于病原的詳細情況未見報道[14]；遼寧地區(qū)主要以褐斑病、紫輪病、銹病等真菌性病害為主，但僅對褐斑病病原銳頂鐮孢菌F.acuminatum的生物學特性和防治方式進行了較為詳細地探討[13，15-16]。湖南玉竹主產區(qū)病原的報道很少，僅有人初步報道了病害的調查結果[4，17-18]，認為根腐病為主要病害，但未見對其病原的詳細研究。

呂勁鋒等[19]曾報道廣東地區(qū)玉竹主要病原為腐皮鐮刀根生?；虵.solani(Mart.)Sacc.f.sp.radicicola(Wr.)Snyd.&Hans.，有報道認為湖南邵東玉竹根腐病病原也為該菌[4，17-18]。但本研究的結果表明：湖南邵東玉竹根腐病的主要病原為芬芳鐮刀菌F.redolens。出現(xiàn)這種差異的原因可能是玉竹根腐病由幾種不同病原共同侵染造成，由于采樣時間和采樣地點的差異，導致分離得到的優(yōu)勢菌株差異較大。具體原因因為前人研究資料缺乏，暫時難有定論，還需要進一步深入的研究和更多的數據支持。

芬芳鐮刀菌F.redolens能引起作物發(fā)生病害的報道近年來逐漸增多[20-22]，但未見引起玉竹病害的報道。F.redolens是一類形態(tài)比較特殊的鐮刀菌，其分類地位在不同的分類系統(tǒng)中并不相同。它與尖孢鐮刀菌F.oxysporium都屬于鐮刀菌屬美麗組，且形態(tài)極其相似。在美麗組中，所有分類系統(tǒng)中都包含尖孢鐮刀菌F.oxysporium。而芬芳鐮刀菌F.redolens.，在Booth[7]系統(tǒng)中將其作為1個變種(尖孢鐮刀菌芬芳變種)進行描述，沒有將F.redolens獨立為種；在John F.Leslie等[8]的系統(tǒng)中則單獨作為1個種；在Snyder & Hansen和Nelson，Toussoun & Marasas系統(tǒng)中沒有單獨劃分為1個種，而是歸在F.oxysporum種內[23]。鑒于鐮刀菌屬真菌形態(tài)的復雜多變性及F.redolens與F.oxysporium的高度相似性，本實驗采用了目前應用較多的TEF-1α序列的分子鑒定方法進行鑒定[24-27]，同時也比較了ITS序列測定的鑒定方法，結果表明TEF-1α序列測定的鑒定方法可以達到鑒定的目的。

[1] 潘清平，周日寶，賀又舜，等.邵東縣玉竹種植基地的概況調查[J].湖南中醫(yī)學院學報，2003，23(4)：48-49.

[2] 梁海霞，李煥德.玉竹的藥理活性研究進展[J].中南藥學，2008，6(3)：342-344.

[3] 國家藥典委員會.中國藥典.[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：78-79.

[4] 吳社高，吳明志.玉竹病害種類及藥劑防治技術[J].中國植保導刊，2005，25(2)：27-28.

[5] 方中達.植病研究方法[M].第三版.北京：中國農業(yè)出版社，1998：37-66，110-195.

[6] 孫新榮，呼麗萍，劉艷梅，等.半夏塊莖腐爛病病原鑒定和藥效比較[J].中國中藥雜志，2010，35(7)：837-841.

[7] 布斯.鐮刀菌屬[M].陳其瑛，譯.北京：農業(yè)出版社，1983：6-15，167-202.

[8] John F.Leslie，Brett A.Summerell.TheFusariumLaboratory Manual[M].Blackwell Publishing Ltd，2006：5-74，212，238.

[9] Gelfand M A，White T J，et al.PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，eds[M].New York：Innis Academic Press，Inc.，1990：315-322.

[10] 畢武，陳娟，焦曉林，等.北京地區(qū)西洋參根腐病病原鑒定及其致病性[J].植物保護，2011，37(5)：135-138.

[11] 胡彥江，張茹琴.煙臺地區(qū)草莓根腐病病原鑒定及致病性測定[J].北方園藝，2012，(10)：141-144.

[12] 孔瓊，王云月，朱有勇，等.香莢蘭尖孢鐮刀菌生物學特性[J].西南農業(yè)學報，2005，18(1)：47-49.

[13] 周陽陽，楊洪一.玉竹銳頂鐮孢菌的生物學特性及藥劑防治[J].中國農學通報，2010，26(9)：315-318.

[14] 李大慶，夏忠敏，張忠民.貴州省玉竹主要病蟲種類調查及防治技術[J].植物醫(yī)生，2004，17(5)：18-19.

[15] 劉玉章，高景義，陳麗萍，等.遼寧地區(qū)栽培玉竹常見病害及其防治[J].特種經濟動植物，2009，12(5)：50-51.

[16] 常紀良.玉竹主要病蟲害及綜合防治措施[J].特種經濟動植物，2008，11(5)：52-53.

[17] 鄒坤，陳勇.玉竹根腐病的發(fā)生與防治[J].湖南人文科技學院學報，2011，(2)：82-83.

[18] 劉塔斯，肖冰梅，余惠旻.玉竹黃精.藥用動植物種養(yǎng)加工技術[M].北京：中國醫(yī)藥出版社，2001：88-93.

[19] 呂勁鋒，周逵先，戚佩坤.三個重要的藥用作物鐮刀菌病[J].華南農業(yè)大學學報，1994，15(2)：20-22.

[20] Jimenez-Fernandez D，Navas-Cortes J A.，Montes-Borrego M，et al.Molecular and Pathogenic Characterization ofFusariumredolens，a New Causal Agent of Fusarium Yellows in Chickpea[J].Plant Disease，2011，95(7)：860-870.

[21] Ahmad E T，Chantal H，Yantai G.First report ofFusariumredolensfrom Saskatchewan and its comparative pathogenicity[J].Canadian Journal of Plant Pathology.Can J Plant Pathol，2011，33(4)：559-564.

[22] L.Riccioni，A.Haegi，and M.Valvassori，F(xiàn)irst Report of Vascular Wilt Caused byFusariumredolenson Lentil in Italy[J].Plant Disease 2008，92(7)：1132.

[23] 張素軒.鐮刀菌屬分類進展[J].真菌學報，1991，10(2)：85-94.

[24] Bogale M，Wingfield B D，Wingfield M J，et al.Species-specific primers forFusariumredolensand a PCR-RFL Ptechnique to distinguish among three clades ofFusariumoxysporum[J].FEMS Microbiology Letters，2007，271(1)：27-32.

[25] Robert PB，Kerry O D，Suzanne B，et al.Molecular Relationships of Fungi Within the Fusarium redolens-F.hostae Clade[J].Phytopathology，2001，91(11)：1037-1044.

[26] 王建明，李蕊倩，暢引東，等.尖孢鐮刀菌及芬芳鐮刀菌遺傳多樣性的ISSR分析[J].植物病理學報，2011，41(4)：337-344.

[27] Youssuf G，Kerstin Vt.Molecular identification of Fungi[M].Springer-Verlag Berlin Heidelberg.2010：93-131.

BiologicalCharacterizationandPathogenIdentificationofPolygonatumodoratumRootRotinHunan，China

BIwu，ZHOUJiaming，HUANGYanning，CAOliang，ZHUXiaoqi*

(InstituteofAgriculturalandBiologicalResourcesUtilization，HunanAcademyofAgriculturalSciences，Changsha410125，China)

Objective：To confirm the pathogen ofPolygonatumodoratumroot rot in Hunan，China.MethodsIn this study，F(xiàn)ungi was isolated by common method，Pathogenicity was tested according to koch’s postulates，and identification of the fungi were carried out by the method of morphology and molecular biology.The effect of temperature，pH，carbon and nitrogen sources on colony growth was also assessed by the growth rate.ResultsFusariumredolenswas identified as the pathogen ofPolygonatumodoratum.The results showed that the optimum temperature was about 25 ℃，and the optimum pH for hyphae growth was 8-9.The growth of colony was the best with sucrose as the carbon source，and beef extract as the nitrogen source.ConclusionThis study confirmed the pathogen ofPolygonatumodoratumroot rot in Hunan and its biological characterization，which can provide evidence for prevention and treatment of this disease，also benefit to the breeding and disease resistance ofPolygonatumodoratum.

Polygonatumodoratum；Root rot；Pathogen；Fusariumredolens；Biological characterization

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.02.010

2013-05-28)