陳曉芳, 胡守舵, 姬東碩, 黎 靜

實(shí)驗(yàn)研究

脂肪來源基質(zhì)細(xì)胞對超長皮瓣成活比例的影響

陳曉芳, 胡守舵, 姬東碩, 黎 靜

目的探討脂肪來源基質(zhì)細(xì)胞對超長皮瓣成活的影響。方法利用膠原酶消化SD大鼠腹股溝區(qū)的脂肪，經(jīng)過分離培養(yǎng)傳代，將獲得的大量脂肪基質(zhì)細(xì)胞行DiI染色，并在SD大鼠背部形成超比例任意皮瓣模型；將DiI染色后的脂肪基質(zhì)細(xì)胞注射到皮瓣下治療，并與生理鹽水治療組作對比；觀察皮瓣大體情況，計算皮瓣成活率；觀察病理切片毛細(xì)血管密度，熒光顯微鏡檢測脂肪基質(zhì)細(xì)胞在皮瓣內(nèi)的分布和存活狀況。結(jié)果術(shù)后第10 天，皮瓣成活與壞死部分界線清楚，脂肪基質(zhì)細(xì)胞組皮瓣成活率明顯高于生理鹽水組。脂肪基質(zhì)細(xì)胞組和生理鹽水組的皮瓣存活率分別為 (67.4±5.1)%和(52.5±6.5 )%，P<0.05；毛細(xì)血管密度分別為(57.1±4.7)/mm2和(28.7±2.8)/mm2，P<0.05；脂肪基質(zhì)細(xì)胞注射入SD大鼠皮瓣后，脂肪基質(zhì)細(xì)胞存活并參與新生血管的形成。結(jié)論脂肪基質(zhì)細(xì)胞可明顯增加超比例任意皮瓣成活面積，其在臨床治療中有潛在的應(yīng)用和研究價值。

脂肪基質(zhì)細(xì)胞； 超長皮瓣； 大鼠

皮瓣修復(fù)術(shù)是整形外科基本技術(shù)的一種，任意皮瓣因沒有知名血管，皮瓣面積受到很大限制，主要是長寬比例受限，一般為1.0∶1.0～1.0∶1.5。皮瓣移植是修復(fù)組織缺損、重建功能的重要措施之一，提高皮瓣的成活率仍是目前臨床工作需要解決的問題。因此，尋找有效的方法，預(yù)防術(shù)后皮瓣的缺血壞死，具有重要的臨床意義[1]。脂肪來源基質(zhì)細(xì)胞以其大量存在、容易取得、不存在免疫排斥等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。自2013年1～12月，筆者從SD大鼠腹股溝區(qū)獲得脂肪，并經(jīng)分離培養(yǎng)，獲得脂肪基質(zhì)細(xì)胞，觀察脂肪基質(zhì)細(xì)胞能否促進(jìn)血管重建，增加血管的密度，是否能夠促進(jìn)皮瓣的存活，從而發(fā)揮細(xì)胞治療的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料

250～300 g SD雄性大鼠25只(北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，DMEM-F12培養(yǎng)液(SIGMA公司，美國)，胎牛血清(杭州四季青公司，中國)，碳花青熒光染料(CM-DiI)( MOLECULAR PROBES公司，美國)。

1.2 脂肪基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察

根據(jù)李東飛等[2]的方法，將1只SD大鼠用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，無菌條件下，超凈臺內(nèi)取雙側(cè)腹股溝處皮下脂肪，并以PBS反復(fù)沖洗血跡，去除脂肪內(nèi)的筋膜，將脂肪剪成糊狀，加入2倍體積的1.5 g/L的Ⅰ型膠原酶，37 ℃ 恒溫?fù)u床振蕩消化1 h。然后用等量的含10%胎牛血清的DMEM/F-12中和，以200目濾網(wǎng)過濾去除未消化組織，1000 r/min離心10 min(離心半徑15 cm)，10%FBS的DMEM/F-12的培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%CO2、100%飽和濕度條件下進(jìn)行細(xì)胞箱培養(yǎng)。3 d后除去非貼壁細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況，待細(xì)胞生長鋪滿至瓶底約90%以上融合時，用0.25%胰蛋白酶和0.01%EDTA消化貼壁細(xì)胞，按同樣的密度進(jìn)行傳代。取第3代以后的細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀察照相。

1.3 脂肪基質(zhì)細(xì)胞的DiI熒光標(biāo)記

將CM-DiI配制成2.5 μg/ml工作液，按2 ml/瓶加入鋪滿90%脂肪基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)瓶內(nèi)，37 ℃孵育5 min，4 ℃孵育15 min，PBS清洗2次。以0.25%胰酶消化，10%FBS的DMEM/F-12重懸，調(diào)節(jié)濃度為5×106/ml備用。

1.4 大鼠缺血皮瓣模型制備及分組

24只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為脂肪基質(zhì)細(xì)胞組和生理鹽水組，每組12只。每只SD大鼠以1%戊巴比妥鈉行腹腔注射麻醉，背部脫毛，在背部正中設(shè)計一寬3 cm、長8 cm矩形任意型皮瓣，沿設(shè)計線切開皮膚、皮下組織，達(dá)深筋膜淺層，保留真皮下毛細(xì)血管網(wǎng)，于深筋膜淺層表面分離皮下組織，皮瓣完全掀起后，徹底止血，間斷原位縫合。模型建立后，脂肪基質(zhì)細(xì)胞組用注射器吸取離心管中的細(xì)胞，注射于皮瓣的中點(diǎn)以及遠(yuǎn)端皮下，遠(yuǎn)端每1 cm為一段，每段注射含有脂肪基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量約5×106/ml的細(xì)胞懸液各1 ml。對照組按照上法注射等容積的生理鹽水，術(shù)后預(yù)防感染。為了減少操作帶來的誤差，所有手術(shù)均由同一實(shí)驗(yàn)者完成。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 大體觀察 術(shù)后每天觀察大鼠活動、飲食、精神狀態(tài)、皮瓣顏色、腫脹、血運(yùn)、傷口愈合、結(jié)痂等情況，10 d后測量皮瓣壞死區(qū)域的面積。皮瓣壞死面積=壞死的長度×壞死的寬度；皮瓣壞死率=皮瓣壞死面積/皮瓣總面積×100%。

1.5.2 組織學(xué)觀察 術(shù)后第10天皮瓣中軸線上距蒂部4 cm處取皮膚全層，常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色，切片在20倍光鏡下每張隨機(jī)計算20個視野中血管斷面數(shù)目，并計算血管斷面密度。

1.5.3 脂肪基質(zhì)細(xì)胞移植SD大鼠后的生物學(xué)觀察 同樣于皮瓣術(shù)后第10天切取冰凍切片，丙酮固定后在熒光鏡下觀察標(biāo)記有CM-DiI紅色熒光染料的脂肪基質(zhì)細(xì)胞，以紅色熒光的多少來反應(yīng)脂肪基質(zhì)細(xì)胞在SD大鼠皮瓣內(nèi)的增殖及分布情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 脂肪基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察

在倒置顯微鏡下觀察，接種到培養(yǎng)瓶內(nèi)可見少量脂滴，24 h后待細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)液，去除油脂及未貼壁細(xì)胞；細(xì)胞開始大量生長，并呈現(xiàn)星形或多角形(圖1)，成團(tuán)成簇生長，并逐漸融合，呈鋪路石樣生長，待細(xì)胞生長鋪滿培養(yǎng)瓶或大部鋪滿后，經(jīng)消化傳代培養(yǎng)3～4 d，細(xì)胞增殖速度加快并開始互相融合；培養(yǎng)6～7 d，細(xì)胞可達(dá)90%以上融合，平行排列呈漩渦狀或輻射狀，細(xì)胞形態(tài)以長梭形為主，可傳代(圖2)。

2.2 脂肪基質(zhì)細(xì)胞的DiI熒光標(biāo)記

脂肪基質(zhì)細(xì)胞染色后培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞均染色，顯示紅色熒光，再次傳代后，細(xì)胞保持了正常的細(xì)胞形態(tài)，且胞漿染色均勻，細(xì)胞核未染色(圖3)。

2.3 大體觀察及組織病理觀察指標(biāo)

術(shù)后第2 天，兩組皮瓣遠(yuǎn)端即出現(xiàn)不同程度皮膚缺血現(xiàn)象，皮膚變紅或變黑，之后隨時間壞死區(qū)域逐漸變大，術(shù)后第7 天變黑壞死區(qū)域趨于穩(wěn)定。術(shù)后第10 天測量壞死面積，脂肪基質(zhì)細(xì)胞組與生理鹽水組相比，壞死面積較小(圖4,5)。術(shù)后第10天脂肪基質(zhì)細(xì)胞組皮瓣存活率為(67.4±5.1)%，生理鹽水組皮瓣存活率為(52.5±6.5 )%，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

脂肪基質(zhì)細(xì)胞組肉芽組織較為豐富，細(xì)胞成分較多，有較多的新生血管(圖6)；生理鹽水組細(xì)胞成分少見，新生血管較少(圖7)。脂肪基質(zhì)細(xì)胞組和生理鹽水組的皮瓣，平均毛細(xì)血管密度分別為(57.1±4.7)/mm2和(28.7±2.8)/mm2，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

熒光顯微鏡下，脂肪基質(zhì)細(xì)胞呈紅色，均勻分布在皮下筋膜層內(nèi)，表明在細(xì)胞移植后第10天時，MSCs存活良好。脂肪基質(zhì)細(xì)胞組的脂肪基質(zhì)細(xì)胞參與到新生的血管中(圖8)。

3 討論

任意皮瓣由于具有使用方便、操作簡單、不破壞主干血管、繼發(fā)性損傷較小等優(yōu)點(diǎn)而廣泛運(yùn)用于臨床。任意皮瓣是臨床上常用的一種皮瓣，由于其沒有知名血管，毛細(xì)血管是這種皮瓣主要的血供，皮瓣內(nèi)的血管數(shù)及循環(huán)是影響皮瓣成活的最主要因素，故超出一定的長寬比例往往會出現(xiàn)皮瓣遠(yuǎn)蒂端的缺血、缺氧或壞死。皮瓣壞死原因包括動脈供血不足、靜脈回流不暢和缺血再灌注損傷、感染等。但是，由于任意皮瓣受到長寬比例限制，常難以修復(fù)較大范圍的皮膚軟組織缺損。因此，研究如何增加任意皮瓣長度和擴(kuò)大皮瓣面積，以修復(fù)更大缺損，具有重要的臨床意義[3]。

脂肪基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)包含脂肪來源干細(xì)胞等細(xì)胞成分，脂肪來源干細(xì)胞具有良好的分化潛能，不僅能分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，還能分化為肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等[4]。脂肪來源干細(xì)胞作為一種多能干細(xì)胞，廣泛存在于脂肪組織中，容易獲得[5]且不需特殊培養(yǎng)，就可以獲得大量干細(xì)胞，并且價格低廉，不存在排斥及倫理問題，被認(rèn)為是最具有前景的多能干細(xì)胞，廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[6]。脂肪來源干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)已是一項(xiàng)比較成熟的技術(shù)，在基礎(chǔ)研究中得到廣泛應(yīng)用，甚至已應(yīng)用到臨床工作中。

傷口愈合是一個復(fù)雜的過程，需要多種細(xì)胞及細(xì)胞因子的參與，而最近在創(chuàng)傷的研究中，脂肪來源干細(xì)胞已成為研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病小鼠模型中，局部應(yīng)用自體的脂肪來源干細(xì)胞可以加速糖尿病潰瘍的愈合[7]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用脂肪來源干細(xì)胞治療放射性損傷可以減輕水腫，促進(jìn)血管形成[8]。植入的脂肪來源干細(xì)胞可以增加循環(huán)血中內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量，這可能與其分泌的SDF-1有關(guān)。SDF-1是小分子的細(xì)胞因子，屬于趨化因子蛋白家族,循環(huán)血中的內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量減少，脂肪來源干細(xì)胞對缺血肌肉的血管化效果則減弱。所以，脂肪來源干細(xì)胞的旁分泌功能在血管化過程中可能同樣發(fā)揮著更重要的作用[9]。本實(shí)驗(yàn)中也觀察到DiI標(biāo)記后的脂肪基質(zhì)細(xì)胞參與了血管的形成。脂肪基質(zhì)細(xì)胞組皮瓣肉芽組織較為豐富，細(xì)胞成分較多，有較多的新生血管，通過組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，血管密度的增加是皮瓣成活的主要原因。在顯微鏡下觀察可見，脂肪基質(zhì)細(xì)胞呈紅色，均勻分布在皮下筋膜層內(nèi)，表明在細(xì)胞移植后第10 天時脂肪基質(zhì)細(xì)胞存活良好。脂肪基質(zhì)細(xì)胞參與到新生的血管中，新分化的內(nèi)皮細(xì)胞在形成細(xì)小血管的過程中發(fā)揮了作用，這是脂肪基質(zhì)細(xì)胞組任意型皮瓣成活率提高的原因之一。脂肪來源干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間具有高度的協(xié)同作用，從而有效地促進(jìn)了新血管生成，而這些新生的血管可以在幾周內(nèi)重建體內(nèi)的血管網(wǎng)絡(luò)，并保持其穩(wěn)定性[10]。所以，脂肪來源干細(xì)胞在新血管生成方面具有更大的優(yōu)勢[11]，但本研究中的促進(jìn)皮瓣存活的脂肪基質(zhì)細(xì)胞中，是脂肪來源干細(xì)胞起到了一定的作用，還是其他細(xì)胞參與了血管的形成，有待進(jìn)一步研究。

圖1 脂肪基質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)24 h (×100)圖2 脂肪基質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)6 d (×100)圖3 DiI染色后培養(yǎng)24 h (×200)圖4 脂肪基質(zhì)細(xì)胞組術(shù)后10 d 大體觀察圖5 生理鹽水組術(shù)后10 d大體觀察圖6 脂肪基質(zhì)細(xì)胞組術(shù)后10 d組織學(xué)觀察 (×100)圖7 生理鹽水組術(shù)后10 d組織學(xué)觀察 (×100)圖8 脂肪基質(zhì)細(xì)胞組術(shù)后10 d DiI染色 (×200)

Fig1 Cells in primary culture of adipose-derived stromal cell for 24 hours (×100).Fig2 Cells in primary culture of adipose-derived stromal cell for 6 days (×100 ).Fig3 Cultured 24 hours after DiI staining (×200).Fig4 Observation of adipose-derived stromal cell group afer operation 10 days.Fig5 Observation of saline group afer operation 10 days.Fig6 Histologic observation of adipose -derived stromal cell group afer operation 10 days.Fig7 Histologic observation of saline group afer operation 10 days.Fig8 DiI staining of adipose -derived stromal cells group after operation 10 days (×200).

實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)及相關(guān)技術(shù)檢測脂肪來源干細(xì)胞，可以分泌一些可溶性的細(xì)胞因子，如肝細(xì)胞生長因子(HGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)、成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、腫瘤壞死因子-α、白介素6、7、8、11等[12-14]。脂肪來源干細(xì)胞具有多能分化性，可分化成脂肪組織[15]、骨組織、軟骨、肌肉及血管[16]等。本實(shí)驗(yàn)中并未涉及到這方面研究。

脂肪基質(zhì)細(xì)胞如何參與皮瓣的存活過程，如何參與其中，起到了什么樣的作用，作用機(jī)制如何，脂肪中的哪種細(xì)胞成分參與其中，是我們今后研究的方向。

[1] 田詩政, 楊志宏, 陸 華, 等. 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)超比例任意皮瓣成活的初步實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志(電子版), 2012,6(11):2941-2943.

[2] 李東飛, 楊 春, 李 楨, 等. 第4代大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型鑒定[J]. 中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2010,14(23):4207-4210.

[3] 李光早, 孫慶章, 熊竹友, 等. 人脂肪干細(xì)胞對兔任意型皮瓣成活的影響[J]. 中華整形外科雜志, 2011,27(2):119-123.

[4] Mizuno H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review[J]. J Nippon Med Sch, 2009,76(2):56-66.

[5] Sterodimas A, de Faria J, Nicaretta B, et al. Tissue engineering with adipose-derived stem cells (ADSCs): current and future applicat-ions[J]. J Plast Reconstr Aesthet Surg, 2010,63(1):1886-1892.

[6] Tobita M, Orbay H, Mizuno H. Adipose-derived stem cells: current findings and future perspectives[J]. Discov Med, 2011,11(57):160-170.

[7] Nambu M, Kishimoto S, Nakamura S, et al. Accelerated wound healing in healing-impaired db/db mice by autologous adipose tissuederived stromal cells combined with atelocollagen matrix[J]. Ann Plast Surg, 2009,62(3):317-321.

[8] Akita S, Akino K, Hirano A, et al. Mesenchymal stem cell therapy for cutaneous radiation syndrome[J]. Health Phys, 2010,98(6):858-862.

[9] 盛玲玲, 楊 湄, 李青峰. 細(xì)胞移植在皮瓣缺血治療中的應(yīng)用[J]. 中華整形外科雜志, 2010,26(3):234-237.

[10] Traktuev DO, Prater DN, Merfeld-Clauss S, et al. Robust functionalvascular network formation in vivo by cooperation of adipose progenitor and endothelial cells[J]. Circ Res, 2009,104(12):1410-1420.

[11] 鮑 菁, 劉 偉. 脂肪干細(xì)胞促新血管生成的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2010,16(18):2742-2745.

[12] Rehman J, Traktuev D, Li J, et al. Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells[J]. Circulation, 2004,109(10):1292-1298.

[13] Salgado AJ, Reis RL, Sousa NJ, et al. Adipose tissue derived stem cells secretome: Soluble factors and their roles in regenerative medicine[J]. Curr Stem Cell Res Ther, 2010,5(2):103-110.

[14] Kilroy GE, Foster SJ, Wu X, et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: Expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors[J]. J Cell Physiol, 2007,212(3):702-709.

[15] Brayfield CA, Marra KG, Rubin JP. Adipose tissue regeneration[J]. Curr Stem Cell Res Ther, 2010,5(2):116-121.

[16] Cherubino M, Rubin JP, Miljkovic N, et al. Adipose-derived stem cells for wound healing applications[J]. Ann Plast Surg, 2011,66(2):210-215.

Influenceofadipose-derivedstromalcellsonsurvivalrateofover-longflap

CHENXiao-fang,HUShou-duo,JIDong-shuo,etal.

(DepartmentofPlasticandCosmeticSurgery，ThePekingHospitalofIntegratedChinesewithWesternMedicine,Beijing100039,China)

ObjectiveTo explore the influence of adipose-derived stromal cells on over-long flap survival.MethodsThe collagenase was used to digest fat from groin area of SD rat, the stromal cells obtained from separation culture and passages were stained by DiI. A over-proportionate random flap was formed at back of SD rat model, the stained adipose derived stromal cells were injected into the skin flap for treatment, physiological saline was also injected as control. General situation of the flap was observed, flap survival rate was calculated, the capillary density was observed by pathological section and the distribution of adipose-derived stromal cells within the skin flap and survival state were detected by fluorescence microscope.ResultsAt 10 days after operation, boundaries of the survival flap and the necrotic part was clear, The flap survival rate in the adipose-derived stromal cells group was obviously higher than that in the control group, they were (67.4±5.1) % and (52.5±6.5) % respectively (P<0.05). The blood capillary density in two groups were (57.1±4.7)/mm2and (28.7±2.8 )/mm2, respectively (P< 0.05). After injection of adipose stem cells into the SD rat skin flap, adipose-derived stromal cells survived and participated in the angiogenesis.ConclusionAdipose-derived stromal cells can significantly increase the survival area of the over-proportion random flap, it has potential worth of application and research in the clinical treatments.

Adipose-derived stromal cells； Overlength flaps; Rat

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.06.020

R318

A

1673-7040(2014)06-0374-04

2014-02-12)

陳曉芳(1978-)，女，河南人，主治醫(yī)師，碩士.

胡守舵，100039，北京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 整形美容科，電子信箱：hushouduo@126.com

100039 北京，北京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 整形美容科