桑澤杰， 朱帝文， 紀(jì)衛(wèi)政， 顧俊鵬， 張海瀟， 任偉新， 溫 浩

肝泡狀棘球蚴病（hepatic alveolar echinococcosis，HAE）中病原微生物在肝臟內(nèi)具有向外突出生長特點(diǎn)，具有惡性浸潤的增殖方式，使該病有“第二肝癌”、“蟲癌”之稱。絕大多數(shù)患者確診時(shí)已屬晚期，手術(shù)切除率低。口服和靜脈注射阿苯達(dá)唑療效低，且不良反應(yīng)嚴(yán)重［1-2］。世界衛(wèi)生組織將尋找治療包蟲病其他方法列為亟待解決的重大研究課題［3］。臨床及實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，HAE病灶及邊緣帶主要由肝動(dòng)脈供血，門靜脈部分地參與供血，且與微血管密度（MVD）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）呈正相關(guān)［4-8］。采用介入方式經(jīng)肝動(dòng)脈灌注貝伐單抗（bevacizumab）是治療 HAE 的新方法［4，7-9］，但是介入栓塞術(shù)后血管再生問題困擾著介入醫(yī)師。貝伐單抗是第1個(gè)獲得美國FDA批準(zhǔn)上市的抑制腫瘤血管生成的藥物，是VEGF的IgG1抗體，可以與之高親和性結(jié)合阻斷VEGF介導(dǎo)的血管生成，降低血管通透性，抑制腫瘤生長［10］?？寡芩幬锏膶?shí)驗(yàn)研究雖然在肝癌研究中得到廣泛應(yīng)用，但在HAE的治療中少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)基于此假設(shè)進(jìn)行貝伐單抗抑制HAE大鼠血清VEGF的探索性研究，了解貝伐單抗對(duì)HAE的治療作用，為進(jìn)一步研究貝伐單抗治療HAE提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取體質(zhì)量 （0.20±0.05）kg的SPF級(jí)Wistar雌性大鼠［新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供給， 合格證號(hào)： FYXK（新）2003-0001］，參照相關(guān)文獻(xiàn)制作Wisar大鼠的HAE動(dòng)物模型［11］。用超聲診斷和篩查大鼠HAE的感染狀況，并證實(shí)HAE在大鼠肝實(shí)質(zhì)內(nèi)成功接種［12］。選取非鈣化型HAE。

1.1.2 器材 氯胺酮、地西泮、阿托品、GE超聲診斷儀、EMS切片機(jī)、無水乙醇（分析純）、甲醛溶液（分析純）、貝伐單抗（bevacizumab，商品名 Avastin，美國Roche公司）。人VEGF檢測(cè)試劑盒（武漢博世德生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：參照相關(guān)文獻(xiàn)配制Wistar大鼠麻醉藥物，把氯胺酮、地西泮、阿托品按1∶1∶0.5配伍，并用0.9%氯化鈉溶液按1∶1配制并稀釋麻醉藥物，按7 ml/kg行腹腔麻醉給藥，麻醉大鼠后背，脫毛并仰臥固定在鼠板上，參照外科標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)腹部備皮并常規(guī)消毒、鋪巾，手術(shù)刀在劍突下1 cm略偏左切3～5 cm縱行切口，逐層切開皮膚入腹并游離腸管，暴露HAE病灶及大鼠腹腔干動(dòng)脈。視野范圍內(nèi)保持清晰，并在直視下超選擇性植入自制導(dǎo)管在肝動(dòng)脈內(nèi)部備用。

1.2.1.2 分組及處理：HAE種植6個(gè)月后行超聲檢查，40只成功接種HAE，病灶直徑達(dá)（1.0±0.2）cm，隨機(jī)分成空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，分別經(jīng)肝動(dòng)脈灌注0.9%氯化鈉溶液和貝伐單抗。術(shù)后兩組結(jié)扎肝固有動(dòng)脈，分別于術(shù)后7、14、21和28 d鼠尾靜脈取血，在最后1 d取HAE組織緣帶標(biāo)本，將所得標(biāo)本常規(guī)置甲醛中固定48 h，石蠟包埋，連續(xù)4 μm切片（每份標(biāo)本5張），脫蠟、染色，在光鏡下觀察HAE病理組織。光鏡下觀察病理切片依據(jù)大鼠泡球蚴角質(zhì)層、生發(fā)層的病理學(xué)形態(tài)改變及育囊發(fā)育情況分為3級(jí)［13］。 0級(jí)（基本正常）：泡狀棘球蚴結(jié)構(gòu)基本正常，多數(shù)見育囊或芽生結(jié)構(gòu)，育囊內(nèi)有數(shù)量不等的原頭節(jié)，鈣顆粒形態(tài)正常。Ⅰ級(jí)（變性改變）：泡狀棘球蚴結(jié)構(gòu)存在，角質(zhì)層和生發(fā)層可辨認(rèn)，組織普遍變性腫脹，很少見育囊和原頭節(jié)。Ⅱ級(jí)（壞死）：泡狀棘球蚴結(jié)構(gòu)失常，生發(fā)層細(xì)胞核固縮、溶解或消失，育囊與原頭節(jié)少見。偶見鈣顆粒，形態(tài)模糊。重者有纖維組織增生和炎性細(xì)胞浸潤。

1.2.2 血清學(xué)及病理學(xué)檢測(cè)

1.2.2.1 血清VEGF檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）法檢測(cè)血清VEGF，在反應(yīng)孔加入稀釋液，每孔加入50 μl標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，于空氣恒溫?fù)u床上孵育2 h。倒出微孔板中液體，每孔加入400 μl沖洗緩沖液后倒出，再加入沖洗緩沖液，反復(fù)洗滌4次。每孔加入200 μl VEGF結(jié)合物孵育2 h后洗滌。每孔加入200 μl基質(zhì)溶液，孵育30 min。加底物液顯色后終止反應(yīng)。血清VEGF放在ELISA檢測(cè)儀上，于450 nm處，用空白的對(duì)照孔調(diào)零點(diǎn)后測(cè)各孔吸光度（A）值，A值經(jīng)過Curve Expert處理獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線 讀出待測(cè)樣本的濃度。

1.2.2.2 肝功能檢測(cè)：檢測(cè)兩組大鼠治療前后的肝功能各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用表示，若資料服從正態(tài)分布，各組方差齊，采用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠HAE的病理改變

實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)照組死亡2只，實(shí)驗(yàn)組死亡1只。在藥物灌注后第28天，對(duì)照組病理變化以0級(jí)（基本正常）為主（9/18），光鏡下可見泡狀棘球蚴結(jié)構(gòu)基本正常，囊壁生發(fā)層、角質(zhì)層生長良好；Ⅰ級(jí)（變性）7只，Ⅱ級(jí)（壞死）2只，光鏡下角質(zhì)層、生發(fā)層模糊，部分生發(fā)層細(xì)胞核溶解。實(shí)驗(yàn)組以Ⅰ級(jí)（變性）為主（11/19），光鏡下可見泡狀棘球蚴結(jié)構(gòu)失常，角質(zhì)層、生發(fā)層普遍變性、分離或斷裂、脫落，皮層變薄，部分結(jié)構(gòu)被破壞，囊泡內(nèi)原頭節(jié)變形、崩解。肝細(xì)胞可見少量變性、壞死和纖維組織增生；0級(jí)（基本正常）改變6只，Ⅰ級(jí)（變性）改變2只。

2.2 肝動(dòng)脈灌注貝伐單抗對(duì)肝功能的影響

術(shù)后第7天，實(shí)驗(yàn)組天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）為（169.21 ± 7.71）u/L，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）為（44.21 ±2.08）u/L， 與對(duì)照組分別為 （167.21 ± 4.27）u/L、和（46.15±3.04）u/L比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。此后，實(shí)驗(yàn)組AST和ALT水平逐漸下降，第14天時(shí)略高于正常水平，AST為 （119.41±7.21）u/L，ALT 為 （38.53 ± 2.31）u/L， 而 對(duì) 照組 AST 為（115.41 ± 5.35）u/L，ALT 為（37.13 ± 2.42）u/L，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）（圖1、2）。 實(shí)驗(yàn)組第21、28天 AST分別為（106.41± 5.25）u/L 和（106.32±4.25）u/L，ALT 分別為 （32.53 ± 3.24）u/L 和 （33.47 ±3.04）u/L，恢復(fù)至正常水平，而對(duì)照組AST分別為（105.32 ± 7.33）u/L 和（104.21 ± 2.26）u/L，ALT 分別為（33.32 ± 2.31）u/L 和（32.12± 3.34）u/L，組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 血清VEGF表達(dá)

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組手術(shù)前、后的VEGF表達(dá)見表1。

圖1 兩組術(shù)前及術(shù)后天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的變化

圖2 兩組術(shù)前及術(shù)后丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的變化

表1 兩組大鼠手術(shù)前、后的VEGF表達(dá)

表1 兩組大鼠手術(shù)前、后的VEGF表達(dá)

注：與術(shù)前及對(duì)照組比，aP＜0.05；與術(shù)后28 d比bP＜0.05

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3 討論

開腹注射HAE造模要有肝細(xì)胞增生和肝硬化背景。HAE以肝動(dòng)脈供血為主，而且全身免疫系統(tǒng)未被徹底破壞，因此與人體原發(fā)性HAE的臨床情景較相似［14-15］。HAE血管造影動(dòng)脈期表現(xiàn)為動(dòng)脈增粗、迂曲、包繞，呈“手握球”征象［4］；在毛細(xì)血管期可見病灶呈環(huán)行染色，中央?yún)^(qū)無染色。間接門脈造影表現(xiàn)可見由于腫塊效應(yīng)所致的門脈分支受壓推移改變。HAE病灶與周圍肝組織間邊緣浸潤帶區(qū)域血流灌注高于病灶內(nèi)部及周圍肝臟組織，CT灌注成像及成像參數(shù)與微血管密度 （MVD）、VEGF-a呈正相關(guān)，大鼠HAE病灶對(duì)周邊肝組織是以擠壓及壓迫為主，主要表現(xiàn)為缺氧、缺血的病理表現(xiàn)，周邊浸潤增殖區(qū)存在豐富的微血供，且HIF-1α與CD34均呈高表達(dá)狀態(tài)，與超聲造影后的環(huán)狀增強(qiáng)區(qū)與MVD的結(jié)果一一對(duì)應(yīng)［8，16］。 實(shí)驗(yàn)組術(shù)后 2、3 周血清 VEGF表達(dá)持續(xù)下降，與術(shù)前及對(duì)照組相比，術(shù)后4周恢復(fù)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，說明血清VEGF在術(shù)后得到持續(xù)抑制。我們推測(cè)，HAE病灶邊緣帶的豐富血供與血清VEGF高表達(dá)呈正相關(guān)，而HAE病灶內(nèi)部血供的缺失與VEGF低表達(dá)相一致，仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

貝伐單抗是人工合成的針對(duì)VEGF的IgG1型單克隆抗體，特異性與內(nèi)皮細(xì)胞VEGF上的受體信號(hào)結(jié)合［10］，阻斷 MAPK/ERK通路，以及上調(diào) Bax/Bc-l 2比率，抑制VEGF的抗凋亡作用而促進(jìn)凋亡，破壞新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，阻斷邊緣帶營養(yǎng)供應(yīng)而“殺死”HAE，同時(shí)對(duì)正常血管幾無影響，對(duì)正常肝細(xì)胞也無影響。根據(jù)Folkman等［17］的理論，當(dāng)腫瘤局部乏氧時(shí)，腫瘤血管的生長一方面依賴于腫瘤細(xì)胞釋放血管生長因子激活血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移；另一方面內(nèi)皮細(xì)胞旁分泌血管生成促進(jìn)因子刺激腫瘤細(xì)胞的生長，尤其是VEGF在其中起著極其重要的調(diào)節(jié)作用［6］。HAE病灶與周圍肝組織間邊緣浸潤帶高表達(dá)MVD和VEGF。抗血管生成藥物能下調(diào)體內(nèi)的促血管生成因子，上調(diào)體內(nèi)的血管生成抑制因子，通過改變血管生成調(diào)節(jié)因子的平衡關(guān)系，發(fā)揮抗血管生成作用［7-8］。本實(shí)驗(yàn)將貝伐單抗肝動(dòng)脈給藥，相對(duì)于靜脈給藥既經(jīng)濟(jì)，又減低對(duì)機(jī)體的影響，而且貝伐單抗可從分子水平抑制血管新生，使血管內(nèi)皮細(xì)胞休眠、衰老或凋亡，以間接抑制HAE邊緣帶細(xì)胞的生長。我們通過建立大鼠HAE模型并行選擇性肝動(dòng)脈灌注術(shù)，發(fā)現(xiàn)術(shù)后HAE血清VEGF明顯下降，尤以術(shù)后7 d最為明顯，術(shù)后28 d又恢復(fù)至原有水平。病理學(xué)結(jié)果表明，HAE病灶病理改變及病灶大小不明顯，邊緣帶組織VEGF表達(dá)情況需進(jìn)一步探究。本實(shí)驗(yàn)尚不能證明血清VEGF與HAE轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系。

從目前已進(jìn)行的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，介入治療HAE可在較短時(shí)間內(nèi)從病理學(xué)角度觀察到泡球蚴組織發(fā)生變性、壞死［7，9，18］，說明通過介入技術(shù)治療HAE是切實(shí)、可行的。貝伐單抗經(jīng)肝動(dòng)脈灌注治療大鼠HAE的實(shí)驗(yàn)表明，貝伐單抗可明顯減緩HAE的VEGF表達(dá)，因?yàn)閂EGF主要在缺氧的細(xì)胞及其周圍基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，貝伐單抗不僅破壞了HAE組織細(xì)胞本身，還破壞了HAE賴以生存的微環(huán)境，從而抑制HAE的迅速生長，但是單純采用貝伐單抗不能殺死HAE，只能延緩生長速度，因此，聯(lián)合阿苯達(dá)唑治療將是下一步研究的重點(diǎn)。

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