許喬艷，韓瑞枝，李江華，堵國(guó)成，劉龍，陳堅(jiān)

1 江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122

2 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122

3 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝及技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122

維生素C (Vitamin C, VC)，又稱L-抗壞血酸 (L-Ascorbic Acid, L-AA)，是一種水溶性維生素。VC參與很多體內(nèi)生理活動(dòng)，在保持和促進(jìn)人體健康以及動(dòng)物生長(zhǎng)方面具有重要的作用[1-3]。VC用途很廣泛，可以作為酸味劑、還原劑、抗氧化劑、漂白劑和穩(wěn)定劑，廣泛應(yīng)用于化妝品、食品和醫(yī)藥等行業(yè)中[4]。但VC本身極不穩(wěn)定，位于C2位置上的羥基很容易受pH、熱及Cu2+、Fe2+影響而發(fā)生氧化還原反應(yīng)，導(dǎo)致其生理活性迅速減弱甚至消失，使其在應(yīng)用上受到了很大的限制[5-7]。因此，為了提高VC的穩(wěn)定性，許多VC衍生物相繼出現(xiàn)，主要包括：VC金屬鹽，VC酯類以及糖基化VC[8-9]。由于VC糖基衍生物具有安全、穩(wěn)定性強(qiáng)、在體內(nèi)易降解產(chǎn)生L-AA等優(yōu)點(diǎn)，能更好地為人體和動(dòng)物吸收和利用，因而更具優(yōu)勢(shì)。在所有的VC糖基衍生物中，以 2-O-D-吡喃葡糖基-L-抗壞血酸(AA-2G)研究最多，應(yīng)用最為廣泛，成為最理想的VC衍生物[7]。

AA-2G是利用糖基轉(zhuǎn)移酶特異性的轉(zhuǎn)糖基作用將糖基供體上的葡萄糖苷轉(zhuǎn)移到VC的C2上合成的。糖基轉(zhuǎn)移酶的選擇與使用是整個(gè)AA-2G合成中的重要環(huán)節(jié)，直接影響到AA-2G的合成效率[10]。目前報(bào)道過(guò)的糖基轉(zhuǎn)移酶有：α-葡萄糖苷酶[11]、環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 (CGT酶)[12]、淀粉酶[13]、蔗糖磷酸化酶[14]和 α-異麥芽糖基-吡喃葡糖形成酶[15]。其中來(lái)源于軟化類芽胞桿菌Paenibacillus macerans的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 (CGT酶(EC2.4.1.19))因其催化生產(chǎn) AA-2G的高產(chǎn)物特異性而被認(rèn)為是最優(yōu)選擇[16]。CGT酶是一種多功能型酶，能催化3種轉(zhuǎn)糖基反應(yīng) (歧化、環(huán)化和耦合反應(yīng))和水解反應(yīng)[9,17]。它可以將一個(gè)或多個(gè)糖基供體環(huán)上的糖殘基α-1, 2糖苷鍵接于L-AA的C2原子上進(jìn)行修飾得到 AA-2G(n)(“n”代表連接到L-AA上的糖基數(shù)量)，再由糖化酶的作用水解成AA-2G[18]。

研究發(fā)現(xiàn)以環(huán)糊精為糖基供體時(shí)，產(chǎn)物專一性比較高，但是以α-環(huán)糊精為糖基供體，成本太高；以β-環(huán)糊精為糖基供體，由于β-環(huán)糊精的溶解度較低，酶促反應(yīng)效率受到較大限制，均不適用于 AA-2G大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[16,19]。因此，以價(jià)格低廉且易溶的麥芽糊精為糖基供體高度專一性地合成AA-2G具有重要意義。X-射線衍射研究表明 CGT酶表面存在一個(gè)明顯的底物結(jié)合凹槽，在底物結(jié)合凹槽中存在9個(gè)亞位點(diǎn)，標(biāo)記為+2～–7，每個(gè)亞位點(diǎn)能結(jié)合一個(gè)葡萄糖殘基[20]。在之前的研究中，我們已經(jīng)對(duì)–3亞位點(diǎn)附近的氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變并獲得較理想的結(jié)果，說(shuō)明–3亞位點(diǎn)是改善CGT酶對(duì)麥芽糊精的底物特異性的有效位點(diǎn)[21]。前期研究發(fā)現(xiàn)+1亞位點(diǎn)亦是CGT酶催化轉(zhuǎn)糖基的關(guān)鍵位點(diǎn)[22]。本研究中，我們對(duì)+1亞位點(diǎn)附近涉及的氨基酸殘基：Leu194、Ala230和His233進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變，旨在考察亞位點(diǎn)+1處突變對(duì)CGT酶以麥芽糊精為糖基供體特異性合成AA-2G的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

P. macerans JFB05-01系本研究室從淀粉生產(chǎn)企業(yè)附近的土壤中篩選獲得，菌種保藏在國(guó)家典型微生物保藏中心 (保藏號(hào)：CCTCC M203062)；克隆宿主菌E. coli JM109和表達(dá)宿主菌E. coli BL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保藏?？寺≠|(zhì)粒 pMD19T-simple和表達(dá)質(zhì)粒 pET-20b(+)購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；重組質(zhì)粒pET-20b(+)/cgt由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏(GenBank Accession No. AF047363)。

1.1.2 酶和試劑

質(zhì)粒小量提取試劑盒、氨芐青霉素及麥芽糊精 (DE15-20)購(gòu)自上海生工生物工程公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、定點(diǎn)突變?cè)噭┖小CR 產(chǎn)物純化試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq酶、PrimerStarDNA聚合酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。AA-2G購(gòu)自日本林原生化研究所，L-AA購(gòu)自江蘇江山制藥有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基LB、TB均按Invitrogen公司操作手冊(cè)方法配制。

1.2 方法

1.2.1 突變質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

以質(zhì)粒pET-20b(+)/cgt為模板，設(shè)計(jì)引物，采用突變?cè)噭┖幸徊絇CR法對(duì)CGT酶 +1亞位點(diǎn)附近的氨基酸殘基 (Leu194、Ala230、His233)進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變。以第一輪突變的產(chǎn)物為模板進(jìn)行兩點(diǎn)和三點(diǎn)復(fù)合突變。Leu194、Ala230、His233定點(diǎn)飽和突變及復(fù)合突變的引物見表1。

表1 定點(diǎn)突變引物Table 1 Primers used for site-directed mutagenesis

PCR產(chǎn)物純化后，經(jīng)定點(diǎn)突變?cè)噭┖刑幚磙D(zhuǎn)化E. coli JM109，挑取陽(yáng)性克隆，送上海生物工程有限公司測(cè)序。將鑒定正確的突變質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E. coli BL21 (DE3)，得到含有突變質(zhì)粒的基因工程菌。

1.2.2 突變體的生產(chǎn)與純化

種子培養(yǎng)：將含突變質(zhì)粒的 E. coli BL21(DE3)接入裝有20 mL LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，回旋式搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)溫度為37 ℃，培養(yǎng)8 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按4% (V/V)的接種量，接種至裝有100 mL TB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，開始培養(yǎng)溫度為 37 ℃，搖床轉(zhuǎn)速 200 r/min，當(dāng)菌體培養(yǎng)至OD600為0.6時(shí)，添加IPTG至0.01 mmol/L，迅速轉(zhuǎn)至25 ℃搖床，繼續(xù)誘導(dǎo)90 h。

各培養(yǎng)基使用前添加100 μg/mL氨芐青霉素。

含有突變質(zhì)粒的基因工程菌培養(yǎng)90 h后的發(fā)酵液在8 000 r/min、4 ℃下離心15 min，除去菌體，得上清即粗酶液。所有飽和突變體粗酶液的純化均采用Ni柱一步親和層析法[5]。

1.2.3 AA-2G的合成與檢測(cè)

將純化后的酶液用醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 5.5)稀釋至蛋白濃度為1 mg/mL，取適量與底物麥芽糊精和L-AA (5%, W/V)混合，以2 mL甘油管作為反應(yīng)容器，基本裝滿，黑色紙包裹避光避氧下37 ℃反應(yīng)24 h，然后加入10 U/mL糖化酶在65 ℃、pH 5.5條件下反應(yīng)24 h，通過(guò)HPLC方法檢測(cè)AA-2G產(chǎn)量。

HPLC檢測(cè)AA-2G產(chǎn)量方法：酶反應(yīng)樣品通過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾，使用Amethyst C18-H柱 (4.6 mm×250 mm, Sepax, America)檢測(cè)。檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm；流動(dòng)相：0.05 mol/L KH2PO4/H3PO4(pH 2.0)；流速：0.6 mL/min。在此條件下，在大約10 min時(shí)會(huì)出現(xiàn)AA-2G的流出峰。AA-2G濃度通過(guò)峰面積計(jì)算而得。

在初始轉(zhuǎn)化條件 (37 ℃，pH 5.5)的基礎(chǔ)上，考慮不同反應(yīng)溫度(20 ℃、28 ℃、36 ℃、44 ℃和52 ℃)和 pH (醋酸-醋酸鈉緩沖液：pH 4.0、4.5、5.0、5.5和6.0；磷酸緩沖液：pH 6.0、6.5、7.0和8.0）對(duì)野生型/突變型CGT酶合成AA-2G的影響。

將野生型(突變型)CGT酶與不同濃度的麥芽糊精(0.23、0.46、1.16、2.3、11.6和23.2 mmol/L)和 L-AA (2.83、5.67、28.3、56.7 和 141.5 mmol/L)混合反應(yīng)測(cè)定AA-2G合成的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。采用SigmaPlot (Jandel Scientific)擬合數(shù)據(jù)，得到下面的公式：

乒乓(Ping-Pong)反應(yīng)機(jī)制：

底物抑制反應(yīng)機(jī)制：

其中：v為不同底物濃度下的反應(yīng)速率 (每毫克酶每小時(shí)催化生成AA-2G的量，mmol/(L·mg·h))；Vmax為反應(yīng)的最大速率(mmol/L·mg·h)；a 和 b 分別為糖基供體 (麥芽糊精)和受體 (L-AA)的濃度 (mmol/L)；KmA和KmB分別為底物麥芽糊精和L-AA的親和常數(shù)；KiB為底物L(fēng)-AA的抑制常數(shù)。

1.2.4 酶活測(cè)定

甲基橙法測(cè)定 α-環(huán)化活力的方法[23]：取適當(dāng)稀釋的酶液0.1 mL，加入裝有0.9 mL預(yù)先用50 mmol/L磷酸緩沖液 (pH 6.5)配制的3%可溶性淀粉溶液中，在40 ℃下反應(yīng)10 min后，加入1.0 mL 1.0 mol/L的鹽酸停止反應(yīng)，再加入1.0 mL用 50 mmol/L磷酸緩沖液配制的0.1 mmol/L甲基橙，在16 ℃下保溫20 min，在505 nm下測(cè)定吸光度。一個(gè)酶活單位定義在該條件下每分鐘生成1 μmol α-環(huán)糊精所需酶量。

淀粉水解活力測(cè)定方法[9]：將適量的酶液加入到含2%可溶性淀粉的50 mmol/L磷酸緩沖液中 (pH 6.5)，50 ℃反應(yīng)10 min，然后用DNS法測(cè)定還原糖濃度。一個(gè)酶活單位定義在該條件下每分鐘生成1 μmol還原糖所需酶量。

歧化反應(yīng)活力測(cè)定方法[9]：將含有6 mmol/L供體底物 4-硝基苯基-α-D-麥芽庚糖-4-6-O-亞乙基 (EPS)和 10 mmol/L受體底物麥芽糖的10 mmol/L檸檬酸緩沖液 (pH 6.0)在50 ℃保溫10 min中，然后加入適當(dāng)稀釋的酶液0.1 mL反應(yīng)，每0.5 min 取100 μL 反應(yīng)樣品加入20 μL 1.2 mol/L HCl (4 ℃)，然后在60 ℃保溫10 min使CGTase失活。隨后，加入 20 μL 1.2 mol/L NaOH中和，將樣品加到磷酸緩沖液 (pH 7.0)，并加入 60 μL (1 U)α-糖苷酶于 37 ℃反應(yīng)60 min。加入1 mL 1 mol/L碳酸鈉使樣品pH升至 8以上，在 401 nm波長(zhǎng)下側(cè)吸光值(ε401=18.4 mmol/L)。1單位酶活定義為每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol的酶的量。

1.2.5 突變體的晶體結(jié)構(gòu)模擬

野生型 (突變型)CGT酶的理論晶體結(jié)構(gòu)通過(guò)SWISS-MODEL蛋白模擬在線服務(wù)器 (http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html[24])進(jìn)行同源模擬獲得，模板為來(lái)源于B. circulans 251的CGT酶 (PDB編碼：1CXK)[25]。理論結(jié)構(gòu)與模板具有68.4%的同源性，序列對(duì)比顯示僅在249位的氨基酸存在差異。所有分子結(jié)構(gòu)圖形均由Accelrys Discovery Studio Client 2.5軟件制作。通過(guò)組合擴(kuò)展方法 (http://cl.sdsc.edu/[26])進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對(duì)，對(duì)模型進(jìn)行PROCHECK[27]、Verify3D[28]和ProQ[29]分析，發(fā)現(xiàn)有 95%的殘基位于理想?yún)^(qū)域，僅 0.2%位于未知區(qū)域。模型與模板之間的根均方偏差 (RMSD)也由組合擴(kuò)展方法[26]計(jì)算而得，發(fā)現(xiàn)模型與模板的外觀結(jié)構(gòu)十分相似 (通過(guò)Cα原子最小二乘法原則進(jìn)行疊加，RMSD為0.5 ?)。麥芽九糖抑制劑由模板PDB 1CXK的活性位點(diǎn)轉(zhuǎn)移至模型的活性位點(diǎn)。最后，酶-底物反應(yīng)的能量由Accelrys Discovery Studio Client 2.5提供的Amber-based能量最小化方法計(jì)算獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體的AA-2G合成

所有的突變體均由定點(diǎn)突變技術(shù)成功構(gòu)建并經(jīng)DNA測(cè)序鑒定正確。將野生型和飽和突變獲得的所有突變型CGT酶經(jīng)E. coli BL21 (DE3)表達(dá)，SDS-PAGE鑒定發(fā)現(xiàn)表達(dá)水平及分子量均無(wú)明顯變化。粗酶液經(jīng)Ni-柱純化，得到電泳純蛋白。

在構(gòu)建的所有單點(diǎn)突變體中，突變體L194N、A230D、H233E相較于野生型CGT酶產(chǎn)AA-2G的量最高 (其他單點(diǎn)突變體產(chǎn) AA-2G的量均低于野生型CGT酶或提高率在10%以下)。在這3株優(yōu)勢(shì)突變體的基礎(chǔ)上，我們?cè)龠M(jìn)行兩點(diǎn)和三點(diǎn)復(fù)合突變，得到L194N/A230D、L194N/H233E、A230D/H233E和L194N/A230D/H233E四株復(fù)合突變體。其中，三點(diǎn)復(fù)合突變體L194N/A230D/H233E以麥芽糊精為糖基供體產(chǎn)AA-2G的量最高為1.95 g/L，較野生型提高了62.5% (表2)。

2.2 突變體酶法合成 AA-2G的最適溫度和最適pH

野生型 (突變型)CGT酶以麥芽糊精為糖基供體合成AA-2G的最適反應(yīng)溫度為36 ℃，與α-CGT酶催化以β-環(huán)糊精為底物合成AA-2G的最適反應(yīng)溫度一致[18]，而重組α-CGT酶催化環(huán)化反應(yīng)的最適溫度為45 ℃[23]。在20–52 ℃的范圍內(nèi)，野生型CGT酶催化合成AA-2G的能力變化不大。當(dāng)溫度升高至44 ℃時(shí)，突變體產(chǎn)AA-2G的量下降較快，52 ℃時(shí)突變體催化合成AA-2G的產(chǎn)量降至36 ℃時(shí)的一半左右 (圖1)。

表2 野生型 (突變型)CGT酶的相對(duì)酶活和AA-2G產(chǎn)量Table 2 Comparison of the reaction activities and AA-2G yields of the wild-type and mutant CGTases

圖1 反應(yīng)溫度對(duì)野生型(突變型)CGT酶以麥芽糊精為糖基供體合成AA-2G的影響Fig. 1 Effect of reaction temperature on AA-2G synthesis by the wild-type and mutant CGTases with maltodextrin as the glycosyl donor.

圖 2反映了不同 pH對(duì)野生型 (突變型)CGT酶催化合成 AA-2G的影響。與野生型相比，突變體的最適反應(yīng) pH有一定程度上的變化。其中，突變體L194N、L194N/A230D與野生型一致，催化合成AA-2G的最適pH為6.5；而突變體 A230D、H233E、L194N/H233E、A230D/H233E和 L194N/A230D/H233E則在pH 7.0時(shí)獲得最高的AA-2G產(chǎn)量。初步推測(cè)，突變體引入的不同極性的氨基酸可能改變了底物結(jié)合活性位點(diǎn)可解離基團(tuán)的 pKa，進(jìn)而造成最適反應(yīng)pH的改變。

圖3為在最適溫度和最適pH條件下，野生型和突變型CGT酶催化合成AA-2G產(chǎn)量隨時(shí)間的變化曲線。在反應(yīng)的初始階段，AA-2G的產(chǎn)量有明顯的增長(zhǎng)，野生型和突變體均在 24 h時(shí)獲得AA-2G 的最高產(chǎn)量 (表 2)。在所有突變體中，L194N/A230D/H233E的產(chǎn)量最高，約為野生型的1.6倍。

圖2 反應(yīng)pH對(duì)野生型 (突變型)CGT酶以麥芽糊精為糖基供體合成AA-2G的影響Fig. 2 Effect of reaction pH on AA-2G synthesis by the wild-type and mutant CGTases with maltodextrin as the glycosyl donor.

圖3 野生型 (突變型)CGT酶以L-AA和麥芽糊精為底物合成AA-2G的時(shí)間產(chǎn)量曲線Fig. 3 Time profiles of AA-2G synthesis by the wild-type and mutant CGTases with L-AA and maltodextrin as the substrates.

圖4 野生型CGT酶(a)和突變體L194N/A230D/H233E (b)合成AA-2G反應(yīng)的Lineweaver-Burk曲線Fig. 4 Lineweaver-Burk plots of the AA-2G synthesis by the wild-type CGTase (A)and the mutant L194N/A230D/H233E (B). L-AA concentrations (mmol/L): ■: 2.83; ●: 5.67; ▲: 28.3; ◆: 56.7; ★: 141.5. Linear regression of the experimental data is represented by black dotted lines, and the calculated values from Equation (1)and(2)are represented by red solid lines.

2.3 突變體的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)及作用機(jī)理分析

為了研究野生型 (突變型)CGT酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，分別測(cè)定了以不同濃度的麥芽糊精和L-AA為底物時(shí) AA-2G的產(chǎn)量。擬合數(shù)據(jù)并對(duì)野生型CGT酶及突變體 L194N/A230D/H233E進(jìn)行Lineweaver-Burk作圖，得到圖4。如圖4A所示，對(duì)野生型CGT酶進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，經(jīng)雙倒數(shù)線性擬合得到的直線符合多底物酶促反應(yīng)的乒乓機(jī)制，與公式(1)計(jì)算的值相符合；而突變體L194N/A230D/H233E線性擬合的結(jié)果與公式(2)計(jì)算的值較符合，說(shuō)明其酶促反應(yīng)符合底物抑制動(dòng)力學(xué)模型，高濃度的底物L(fēng)-AA對(duì)AA-2G的合成存在抑制作用 (圖4B)。另外幾個(gè)突變體的分析結(jié)果也符合公式(2)，詳細(xì)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表3。

突變體的最大反應(yīng)速率 (Vmax)要高于野生型，Km(麥芽糊精)和Kcat/Km(麥芽糊精)值的變化顯示出突變體對(duì)底物麥芽糊精的親和性和酶促反應(yīng)的催化效率與野生型相比都有一定程度的提高。突變體相對(duì)于野生型 Km(L-AA)和 Kcat/Km(L-AA)值的變化則說(shuō)明突變體對(duì)底物 L-AA的親和性有所降低。抑制常數(shù)Ki(L-AA)表明高濃度的L-AA對(duì)突變體K47L/Y89F/N94P/D196Y催化的的酶促反應(yīng)抑制作用最顯著。

我們還考察了突變對(duì) CGT酶 α-環(huán)化活力、淀粉水解活力及歧化活力的影響。如表2所示，突變型 CGT酶的 α-環(huán)化活力降至野生型的一半甚至更低，而除突變體L194N和A23D/H233E的淀粉水解活力較野生型分別降低了18.2%和6.1%外，大部分突變型CGT酶的淀粉水解活力均有一定程度的提高。突變體L194N、A230D、H233E、L194N/A230D、L194N/H233E、A230D/H233E和L194N/A230D/H233E的歧化反應(yīng)活力較野生型CGT酶分別提高了15.6%，25.8%，27.5%，40.2%，47.5%，58.3%和62.5%。這一增長(zhǎng)趨勢(shì)與AA-2G產(chǎn)量的趨勢(shì)一致，說(shuō)明歧化反應(yīng)是以麥芽糊精做為糖基供體生產(chǎn)AA-2G的關(guān)鍵反應(yīng)。

圖5A–D依次為野生型CGT酶和第94位亮氨酸，第230位丙氨酸和第 233位組氨酸分別被天冬酰胺、天冬氨酸和谷氨酸取代的突變體，可以看出突變體與野生型CGT酶的氨基酸側(cè)鏈有很大的差別。

如圖5B，CGT酶第194位的氨基酸由亮氨酸突變?yōu)樘於０?，使?cè)鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，進(jìn)而引發(fā)了附近的氨基酸殘基及整個(gè)空間結(jié)構(gòu)的變化，可能在一定程度上改善了CGT酶與線性底物麥芽糊精間的結(jié)合，提高了AA-2G的合成效率。

如圖5C所示，CGT酶第230位的丙氨酸突變?yōu)樘於彼岷?，與底物分子間的氫鍵作用力較突變前有所增強(qiáng)。增加的氫鍵使底物分子更趨向于第 230位的氨基酸殘基，可能在一定程度上阻滯了線性底物的環(huán)化，造成突變體A230D環(huán)化活力的大幅度降低。然而增強(qiáng)的氫鍵作用力也可能有效改善了突變體A230D對(duì)線性底物(如麥芽糊精)的親和性，更利于其以麥芽糊精為糖基供體合成更高產(chǎn)量的 AA-2G。突變體H233E底物特異性改善的機(jī)理與突變體A230D類似 (圖 5D)。相關(guān)動(dòng)力學(xué)參數(shù) Km(麥芽糊精)和Kcat/Km(麥芽糊精)的變化也證實(shí)了這一點(diǎn)。

圖5 野生型 (突變型)CGT酶與麥芽九糖抑制劑在+1亞位點(diǎn)上作用的模擬結(jié)構(gòu)圖Fig. 5 Close-up the wild-type and mutant CGTases theoretical structure with a maltononaose substrate at subsite +1 (PDB accession code 1CXK). (A)Wild-type CGTase. (B)L194N. (C)A230D. (D)H233E.

表3 野生型 (突變型)CGT酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 3 Kinetic parameters of the wild-type and mutant CGTases

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建了 7株底物麥芽糊精特異性明顯改善的CGT酶突變體，其中三點(diǎn)突變體L194N/A230D/H233E以麥芽糊精為底物合成AA-2G的產(chǎn)量最高為1.95 g/L，較野生型CGT酶提高62.5%。通過(guò)動(dòng)力學(xué)分析和晶體結(jié)構(gòu)模擬我們初步闡述了突變體底物麥芽糊精特異性改善的機(jī)理。研究結(jié)果使我們進(jìn)一步了解了+1亞位點(diǎn)附近氨基酸殘基的突變能有效提高CGT酶與線性底物分子的親和性。為了進(jìn)一步提高AA-2G的產(chǎn)量，還需繼續(xù)開展CGT酶的固定化和轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化等工作。

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