李百勇，王忠民，王謙，詹建軍，黃昭亮，龐醒華，劉志兵，葉才果，李釗明，刁思嫻，張鵬，夏瑜

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阻斷白介素12 p40功能的新型治療性單克隆抗體的開發(fā)

李百勇，王忠民，王謙，詹建軍，黃昭亮，龐醒華，劉志兵，葉才果，李釗明，刁思嫻，張鵬，夏瑜

528437 廣東省中山市，中山康方生物醫(yī)藥有限公司

設(shè)計并利用抗體工程方法構(gòu)建并制備全新序列的阻斷白介素 12（IL-12）p40 功能的單克隆抗體 MAB1，并對其生物學(xué)活性進(jìn)行鑒定，以制備可應(yīng)用于治療多種自身免疫病的 IL-12 通路的阻斷劑。

根據(jù)已有的 IL-12 p40 蛋白序列，設(shè)計、構(gòu)建并制備了全新的單克隆抗體 MAB1，利用間接 ELISA 測定其與抗原結(jié)合的親和力，并用細(xì)胞學(xué)方法鑒定它的生物學(xué)活性。

抗體 MAB1 與 p40 抗原的結(jié)合親和力為0.0399 nmol/L，并能明顯抑制 IL-12 誘導(dǎo)的人皮膚淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原（CLA）水平上調(diào)。其抗原結(jié)合能力以及抑制 IL-12 生物學(xué)活性能力與美國強(qiáng)生公司抗體藥 Stelara（ustekinumab）相當(dāng)或更優(yōu)。

全新構(gòu)建的單克隆抗體 MAB1 可作為 IL-12 通路的高親和力阻斷劑，從而成為自身免疫疾病（例如斑塊型銀屑?。┲委熡眯滤幍呐R床候選藥物。

細(xì)胞因子類； 白細(xì)胞介素 12 亞單位p40； 抗體，單克?。?自身免疫疾病

白介素 12（interleukin-12，IL-12），又名細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞成熟因子（cytotoxic lymphocyte maturation factor，CLMF），或者 NK 細(xì)胞刺激因子（natural killer cell stimulation factor，NKSF），是白介素家族中的一員。IL-12 具有獨(dú)特的異源二聚體結(jié)構(gòu)，是由 p40 和 p35 兩個亞基通過二硫鍵共價連接形成。IL-12 參與機(jī)體的抗腫瘤[1-3]、抗過敏、抗感染[4]過程，但其過量又造成機(jī)體免疫調(diào)節(jié)失衡導(dǎo)致自身免疫病。由IL-12 誘導(dǎo)并促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫已在非肥胖性糖尿?。∟OD）小鼠動物模型[5]、實驗性結(jié)腸炎[6]、膠原性關(guān)節(jié)炎（CIA）以及實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）[7]和實驗性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）[8]動物模型中得到證實。還有許多研究報道 IL-12 參與狼瘡性腎炎的發(fā)病機(jī)制[9]。本文應(yīng)用以晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的單克隆抗體技術(shù)構(gòu)建特異性阻斷 IL-12 p40 抗體，作為 IL-12 通路的阻斷劑，為自身免疫疾?。ɡ绨邏K型銀屑?。┲委熡眯滤幍呐R床研究提供候選藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與主要試劑 293f 細(xì)胞、載體 pcDNA3.1/myc-his(-)A 購自美國 Invitrogen 公司，質(zhì)粒 DNA 經(jīng) Invitrogen 進(jìn)行測序驗證；p40 的 cDNA 購自北京傲銳東源公司[SC124116，IL12B （NM_002187）人cDNA 克隆]；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5a、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；DNA ligation kit 購自 Takara（Ver.2.0 D6022S）；限制性內(nèi)切酶R I、d III購自美國 NEB 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗人 IgG 購自 Jackson Immuno Research 公司；淋巴細(xì)胞分離液購自美國 GE 公司。

1.1.2 儀器 Multiskan FC 型酶標(biāo)儀、分光光度計 NanoDrop-2000 和 CO2培養(yǎng)箱均購自美國 Thermo 公司；JY600C 型電泳儀為君意東方公司產(chǎn)品；C-1000 touch 型 PCR 儀購自美國 Biorad 公司；AKTA Purifier 10 蛋白純化液相色譜系統(tǒng)購自美國 GE 公司；Avanti J-E 型高速落地離心機(jī)購自美國 Beckman 公司；FACS Calibur 型流式細(xì)胞儀購自美國 BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 p40 篩選抗原表達(dá)載體的構(gòu)建 以購買的 p40 cDNA（SC124116）為模板擴(kuò)增 p40 基因，并在其后加上 his6 純化標(biāo)簽，兩端引入I、H I 兩個限制性酶切位點(diǎn)，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收 PCR 產(chǎn)物。

將回收后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和空載體pcDNA3.1/ myc-his(-)A 分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶I、H I 酶切，再用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，利用 DNA ligation kit Ver.2.0 進(jìn)行連接反應(yīng)，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5a，涂布于含有 AMP 的 LB 培養(yǎng)基平板上。挑取平板上的單克隆在 LB 液體培養(yǎng)基進(jìn)行小量培養(yǎng)并進(jìn)行菌落 PCR 驗證，抽提陽性克隆的質(zhì)粒 DNA，并送 Invitrogen 進(jìn)行測序驗證。

1.2.2 p40 篩選抗原（p40-his6）的表達(dá)及純化 將測序鑒定正確的 his 融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染 293f 細(xì)胞，于 37 ℃，8% CO2，130 r/min 環(huán)境下培養(yǎng) 7 d 后，離心收集上清。將上清于 6000 r/min 離心 20 min，再用 0.2 μm 濾膜過濾；濾液經(jīng)超濾濃縮換液至 Buffer A（50 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑，pH 8.0）中，0.2 μm 濾膜再過濾，上樣至已用 PBS 平衡好的 1 ml HisTrap HP 柱；待樣品上完后用 Buffer A 沖洗，流速1 ml/min。然后用 0% ~ 60% Buffer B（50 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH 8.0）15 柱體積線性洗脫，流速 1 ml/min，收集流出峰，并進(jìn)行 SDS-PAGE 檢測；合并相應(yīng)洗脫峰，并用超濾濃縮管濃縮換液至 PBS 中，由此得到抗原 p40-his。

1.2.3 p40 抗體 MAB1 序列的設(shè)計 p40 抗體 MAB1 的序列是根據(jù) p40 蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)[10]設(shè)計。其重鏈氨基酸序列如下：EVQLVQSGAEVKK PGESLKISCQSSGYSFTTYWIGWVRQMPGQGLEWIGIMSPVDSDIRYNPMFRGQVTMSVDKSSSTAYLQWSSLKASDTAMYYCARRRPGQGYFDFWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；其輕鏈氨基酸序列如下：EIVLTQSPATLS ASPGERATISCRASQSVSSWLAWYQQKPGQAPRSLIYAASNLQSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYNIYPYTFEGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLINNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。

1.2.4 p40 抗體 MAB1 表達(dá)載體的構(gòu)建 合成抗體 MAB1 的輕鏈和重鏈 cDNA 片段（包括I 酶切位點(diǎn)、Kozak 序列、信號肽、輕/重鏈的編碼區(qū)和d III 酶切位點(diǎn)，cDNA 序列及擴(kuò)增引物均由中山康方生物醫(yī)藥有限公司設(shè)計），將帶有酶切位點(diǎn)的輕鏈和重鏈 cDNA 片段以及空載體pcDNA3.1/myc-his(-)A 分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶I，d III 雙酶切，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒分別回收酶切產(chǎn)物，利用 DNA ligation kit Ver.2.0 進(jìn)行連接反應(yīng)，將重鏈的 cDNA 插入載體pcDNA3.1/ myc-his(-)A 的I，d III 酶切位點(diǎn)之間。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a，涂布于含有 AMP 的 LB 平板上。挑取 LB 平板上的轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 DH5a 的單克隆用 LB培養(yǎng)基進(jìn)行小量培養(yǎng)并進(jìn)行菌落 PCR 驗證，將含有插入片段的克隆作為陽性克隆，抽提陽性克隆的質(zhì)粒 DNA，并送 Invitrogen 進(jìn)行測序驗證。

1.2.5 p40 抗體 MAB1 的表達(dá)及純化 將測序鑒定正確的 MAB1 重鏈表達(dá)載體和輕鏈表達(dá)載體（1:1）共轉(zhuǎn)染293f細(xì)胞，37 ℃，8% CO2，130 r/min 培養(yǎng) 7 d 后，離心收集上清。將上清 6000 r/min 離心 20 min，并用 0.2 μm 濾膜過濾，收集濾液；濾液上樣至已用 PBS 平衡好的 1 ml HiTrap protein A HP柱中；待樣品上完后用 PBS 沖洗，流速1 ml/min，紫外監(jiān)測為基線；改用 0.1 mol/L 檸檬酸（pH 3.5）洗脫，流速 1 ml/min，收集流出峰，并進(jìn)行 SDS-PAGE 檢測；合并相應(yīng)洗脫峰，并用超濾濃縮管濃縮換液至 PBS 中。

1.2.6 間接 ELISA 測定p40 抗體 MAB1 的半數(shù)有效濃度 EC50酶標(biāo)板用抗原 p40-his（0.125 μg/ml）包被，37 ℃孵育 2 h。加入封閉液 4 ℃孵育過夜。加入梯度濃度的抗體 MAB1 為一抗，37 ℃溫育 30 min。用 HRP 標(biāo)記的羊抗人 IgG 作二抗（0.08 μg/ml），37 ℃孵育 30 min。TMB 顯色劑，用酶標(biāo)儀測 450 nm處值。

1.2.7 CLA 蛋白表達(dá)水平檢測 將新鮮血液與淋巴細(xì)胞分離液按 3:4 的比例混合均勻，離心后取中間白膜狀細(xì)胞層即外周血單核細(xì)胞（PBMC）層，用血液緩沖液清洗 PBMC 后加入含 15%胎牛血清，25 mmol/L β-巰基乙醇，1%雙抗的 RPMI 1640 完全培養(yǎng)基并置于 37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將獲得的 PBMC 按 2 × 106個/ml 密度接種于 6 孔板，加入植物血凝素（phytohaemagglutinin，PHA）（50 μl/ml）培養(yǎng) 3 d 后收集細(xì)胞。按 1 ×105個/孔接種于 96 孔板，加入 IL-12（1 ng/ml）和（或）不同濃度的 MAB1 培養(yǎng) 3 d 后收集細(xì)胞。用 APC（1%）標(biāo)記的抗人皮膚淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原（CLA）抗體孵育 1 h 后，用流式細(xì)胞儀 FL4 通道（APC）檢測 CLA 蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 p40 抗原表達(dá)載體的構(gòu)建及純化

p40 抗原的 cDNA 插入載體 pcDNA3.1/myc- his(-)A 的R I、d III 酶切位點(diǎn)之間，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a 后的菌落 PCR 驗證電泳結(jié)果顯示含有插入片段的克?。寺?4、克隆 5 及克隆 8）為陽性克隆（圖 1）。

陽性克隆的質(zhì)粒 DNA 測序結(jié)果顯示 C 端帶his6 標(biāo)簽的 p40 基因插入了載體pcDNA3.1/myc- his(-)A 中，融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染 293f 細(xì)胞經(jīng)純化后，得到抗原 p40-his 融合蛋白。SDS-PAGE 可見清晰蛋白條帶，分子量約 40 kD，與預(yù)計一致（圖 2）。

bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 500030002000 1000750500250100

Figure 1 Identification of antigen p40 cDNA inby PCR, three clones (clone 4, 5 and 8) were found to be positive clones

kD M 1 2 3 4 5 6 7 116664535 25 1814.4

Figure 2 SDS-PAGE analysis of expression and purification of p40-his antigen

2.2 p40 抗體 MAB1 表達(dá)載體的構(gòu)建及純化

p40 抗體 MAB1 的序列是根據(jù) p40 蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計?？贵w MAB1 的 cDNA 人工合成后，將輕鏈和重鏈 cDNA 插入載體 pcDNA3.1/ myc-his(-)A 的I、d III 酶切位點(diǎn)之間，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a。然后經(jīng)菌落 PCR 驗證，電泳結(jié)果顯示所有克隆均含插入片段，均為陽性克隆（圖 3），抽提出陽性克隆的質(zhì)粒 DNA，經(jīng)測序驗證，測序結(jié)果顯示插入序列正確。

MAB1 重鏈和輕鏈表達(dá)載體經(jīng)轉(zhuǎn)染 293f 細(xì)胞純化后，對得到的抗體 MAB1 進(jìn)行 SDS-PAGE 檢測。如圖 4 所示，SDS-PAGE 檢測純化后的MAB1 目標(biāo)蛋白大約在 50 kD 和 25 kD。

2.3 p40 抗體 MAB1 的親和力測定

采用間接 ELISA 方法檢測p40 抗體 MAB1的半數(shù)有效濃度 EC50，用酶標(biāo)儀檢測在 450 nm 處值并與野生型陽性對照抗體 ustekinumab 進(jìn)行對比。用軟件 softmax pro 6.2 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計算出抗體 MAB1 半數(shù)有效濃度 EC50為 0.0399 nmol/L，ustekinumab 的 EC50為 0.0935 nmol/L（圖 5）。

bp 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10 2000 1000750500250100

Figure 3 Identification of p40 antibody MAB1 inby PCR electrophoresis method

kD 116664535 25 1814.4 重鏈（50 kD）Heavy chain 輕鏈（25 kD）Light chain

Figure 4 SDS-PAGE analysis of expression and purification of p40 monoclonal antibody MAB1

2.4 p40 抗體 MAB1 的細(xì)胞生物學(xué)活性分析

采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測經(jīng)過抗體處理過的PBMC 細(xì)胞的 CLA 水平，結(jié)果顯示加入了 MAB1 及 ustekinumab 的 PBMC 細(xì)胞的 CLA 明顯減少（圖 6）。由于 CLA 的上調(diào)是由 IL-12 誘導(dǎo)產(chǎn)生，因此證明這兩個抗體能抑制 IL-12 誘導(dǎo)CLA 上調(diào)的細(xì)胞學(xué)活性，且 MAB1 與 ustekinumab 相當(dāng)或更優(yōu)（圖 6）。

3 討論

IL12是一種促進(jìn)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，通過與其受體 IL-12R 的相互作用，能夠激活 NK 細(xì)胞，增強(qiáng) NK 細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，也能促進(jìn) IFN-r 的分泌，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞的活化。IL-12 在腫瘤免疫、感染免疫及自身免疫中都發(fā)揮著重要作用。研究表明系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者的 IL-12 的過量表達(dá)會促進(jìn)狼瘡性腎炎（LN）的發(fā)展[9]。節(jié)段性回腸炎（CD）[6]、變應(yīng)性哮喘[11]、實驗性關(guān)節(jié)炎（experimental arthritis）[12]、銀屑病[13]等炎癥疾病的發(fā)生也被證實與 IL-12 的過量表達(dá)相關(guān)。

OD4504 3 2 1 0 –6 –4 –2 0 2 Log (nmol/L)

Figure 5 Analysis of concentration for 50% of maximal effect (EC50) of p40 antibody MAB1 and ustekinumab by using indirect ELISA

IL-12 是由兩個亞單位 p35 和 p40 構(gòu)成的異二聚體。只有當(dāng)兩個亞基形成二聚體時，IL-12 才具有生物學(xué)活性。因此，應(yīng)用單克隆抗體封閉其 p40 亞基可以起到抑制 IL-12 活性的作用，從而達(dá)到治療或者緩解炎癥疾病的目的。目前已經(jīng)證實 IL-23 與 IL-12 共用 p40 亞基，而 IL-23 的過量表達(dá)與多種免疫疾病有關(guān)，所以，選擇 p40 亞基作為阻斷的靶標(biāo)，能夠同時抑制 IL-12 及 IL-23 的活性，對相關(guān)疾病的治療起到更好的作用。相關(guān)研究已證實 p40 單克隆抗體對于多種炎癥疾病能夠達(dá)到良好治療效果[14-16]。目前美國強(qiáng)生公司的IL-12 p40 單克隆抗體ustekinumab 已在美國、英國等多個國家上市，適應(yīng)證為銀屑病。本研究用的 p40 單克隆抗體 MAB1 采用與 ustekinumab 相同的作用靶點(diǎn)，并且試驗證明MAB1 具有更高的親和力及阻斷 IL-12 活性的能力。MAB1 的開發(fā)為包括銀屑病在內(nèi)的多種免疫性疾病的治療提供了新的選擇。

圖 6 流式分析法檢測 MAB1 和 ustekinumab 阻斷 IL-12 誘導(dǎo) CLA 上調(diào)

Figure 6 Flow cytometry analysis of p40 antibodies MAB1 and ustekinumab blockade of IL-12 driven CLA upregulation

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A novel monoclonal antibody directed interleukin 12 p40 blocks IL12 functions

LI Bai-yong, WANG Zhong-min, WANG Qian, ZHAN Jian-jun, HUANG Zhao-liang, PANG Xing-hua, LIU Zhi-bing, YE Cai-guo, LI Zhao-ming, DIAO Si-xian, ZHANG Peng, XIA Yu

To design and produce a new sequence antibody MAB1 that binds to the p40 subunit of IL12 and blocks IL12 function, for treating autoimmune diseases mediated by IL-12 activity.

A monoclonal antibody MAB1 which specifically bond to IL-12 p40 was designed and constructed based on the crystal structure of IL-12 p40. The affinity of MAB1 directed p40 was assessed by indirect ELISA and inhibition of IL-12 induced cutaneous lymphocyte associated antigen (CLA) up-regulation was assessed by FACS analysis.

In the present study, monoclonal antibodyMAB1 was successfully generated. It possessed high binding affinity to p40 and potent inhibitory effect of IL-12 induced CLA up-regulation. These activities were comparible or equivalent to the properties of ustekinumab.

Monoclonal antibody MAB1 is a high affinity IL-12 antagonist and has potential to be developed for autoimmune diseases such as plaque psoriasis.

Cytokims; Interleukin-12 subunit p40; Antibodies, monoclonal; Autoimmune diseases

LI Bai-yong, Email: baiyong.li@akesobio.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.04.007

廣東省中山市 2012 年度創(chuàng)新科研團(tuán)隊項目

李百勇，Email：baiyong.li@akesobio.com

2014-07-03

Author Affiliation: Akeso Biopharma, Inc., Zhongshan, Guangdong 528437, China