孫衛(wèi)國(guó)，張靈霞，熊志紅，劉艷華，程小星

解放軍第309醫(yī)院 結(jié)核病研究所，全軍結(jié)核病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091

角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（keratinocyte growth factor-2，KGF-2）亦稱成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10（fibroblast growth factors-10，F(xiàn)GF-10），是由208個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈多肽，相對(duì)分子質(zhì)量約24×103[1]。KGF-2是脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中的必需調(diào)節(jié)因子[2]，具有廣泛的生物學(xué)功能，在多種因素如潰瘍、急慢性炎癥、燒傷因素等引起的組織器官損傷的修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[3]。目前利用基因工程技術(shù)表達(dá)的重組人KGF-2（rhKGF-2）可能存在的問題是表達(dá)量較低及表達(dá)不穩(wěn)定，尤其是在中試過程中，pBV220-rh?KGF-2出現(xiàn)不表達(dá)現(xiàn)象。我們構(gòu)建了pBV220-rh?KGF-2、pET-24b-rhKGF-2和pQE31-rhKGF-2表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)化對(duì)應(yīng)的表達(dá)宿主菌，比較了同一hKGF-2基因在不同原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)情況，篩選出穩(wěn)定高效的表達(dá)菌株，為探索KGF-2的最佳表達(dá)體系，進(jìn)一步進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

喉癌Hep-2細(xì)胞株，大腸桿菌JM109、M15、BL21（DE3），表達(dá)載體pBV220、pET-24b、pQE31均系本室保存；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、NdeⅠ，T4DNA連接酶購(gòu)自Promage公司、Taq DNA聚合酶和dNTP購(gòu)自TaKaRa公司；人胎肝cDNA文庫(kù)購(gòu)自Clontech公司；SP Sepharose Fastflow購(gòu)自Pharmacia公司；MTT購(gòu)自Sigma公司；rhKGF-2由本室純化冰干保存；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)hKGF-2基因編碼序列及各限制性酶切位點(diǎn)序列特性，設(shè)計(jì)并合成特異性引物，并在各引物的兩端引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，在反向引物中將原終止密碼子TAG改為大腸桿菌偏性的TAA。針對(duì)載體pBV220的正向引物為5′-CGGAATTCATGCAAG CCCTTGGTCAGGACAT-3′（下劃線為EcoRⅠ位點(diǎn)），反向引物為5′-CGGGATCCTTATGAGTGTACCACC AT-3′（下劃線為BamHⅠ位點(diǎn)）；針對(duì)載體pQE31的正向引物為5′-CGGAATTCATGCAAGCCCTTGGTC AGGACAT-3′（下劃線為EcoRⅠ位點(diǎn)），反向引物為5′-CCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCAT-3′（下劃線為HindⅢ位點(diǎn)）；針對(duì)載體pET-24b的正向引物為5′-GGGAATTCCATATGCAAGCCCTTGGTCAGGAC AT-3′（下劃線為NdeⅠ位點(diǎn)），反向引物為5′-CCG CTCGAGTTATGAGTGTACCACCAT-3′（下 劃 線 為XhoⅠ位點(diǎn)）。

1.3 重組hKGF-2表達(dá)載體的構(gòu)建

以人胎肝cDNA文庫(kù)為模板，用正、反向引物通過常規(guī)PCR方法擴(kuò)增得到hKGF-2編碼核酸序列。先后以各限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化各載體對(duì)應(yīng)的宿主感受態(tài)大腸桿菌JM109、M15或BL21（DE3）細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.4 重組hKGF-2的表達(dá)和純化

取測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆菌落接種于抗生素抗性的LB培養(yǎng)基中，于37℃振搖培養(yǎng)，當(dāng)菌液D600nm值達(dá)0.4時(shí)，把pBV220-rhKGF-2表達(dá)宿主菌JM109立即移至42℃進(jìn)行熱誘導(dǎo)5 h；在pET-24b-rhKGF-2和pQE31-rhKGF-2的宿主菌M15和BL21（DE3）中加入IPTG，于37℃誘導(dǎo)7 h；4℃離心收集各載體的表達(dá)菌體，將菌體溶于1×PBS（20 mmol/L，pH7.4，含2 mmol/L EDTA）緩沖液中，超聲波破碎后進(jìn)行14%的SDS-PAGE，分析目的蛋白的表達(dá)量和表達(dá)形式。分別取表達(dá)上清，于4℃層析柜中過SP Sepha?rose Fastflow陽(yáng)離子交換柱，用梯度NaCl溶液洗脫，收集穿過峰和各洗脫峰蛋白，行14%的SDS-PAGE分析。取純化的重組蛋白經(jīng)水透析后冰干保存。

1.5 重組hKGF-2的抗原性和生物學(xué)活性檢測(cè)

取純化的rhKGF-2行14%的SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，以5%的脫脂奶粉在37℃封閉1 h。抗原抗體反應(yīng)中的第一抗體為兔抗hKGF-2抗體，第二抗體為羊抗兔IgG-HRP，ECL暗室自動(dòng)曝光顯影驗(yàn)證各蛋白的抗原性。取冰干保存的rh?KGF-2，用PBS稀釋至1 mg/mL母液備用；用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)喉癌細(xì)胞株Hep-2，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，2×104/孔，24 h后更換無血清的RPMI1640，加入以無菌PBS緩沖液配制的不同濃度的rhKGF-2，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，對(duì)照組以等體積的PBS緩沖液補(bǔ)齊，每組5個(gè)復(fù)孔，MTT法檢測(cè)各孔的D570nm值。

2 結(jié)果

2.1 pBV220-rhKGF-2、pET-24b-rhKGF-2 和pQE31-rhKGF-2載體的構(gòu)建

以人胎肝cDNA文庫(kù)為模板，通過常規(guī)PCR方法擴(kuò)增得到成熟hKGF-2核酸序列。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳顯示，在約500 bp處有明顯的條帶（圖1）。以限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切后，與經(jīng)同樣雙酶切的質(zhì)粒pBV220、pET-24b和pQE31分別進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化各載體對(duì)應(yīng)的表達(dá)感受態(tài)大腸桿菌，分別篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列完全一致。

2.2 rhKGF的表達(dá)和純化

取測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆菌落接種含抗生素的LB培養(yǎng)基，于37℃振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液D600nm達(dá)0.4時(shí)，分別如上所述于42℃熱誘導(dǎo)5 h或于37℃ IPTG誘導(dǎo)7 h。14%SDS-PAGE結(jié)果顯示（圖2），在目的相對(duì)分子質(zhì)量約21×103處，pBV220-rhKGF-2與pET-24b-rhKGF-2表達(dá)系統(tǒng)有明顯的重組蛋白hKGF-2表達(dá)，其中pBV220-rhKGF-2的表達(dá)量占總蛋白的10%，而pET-24b-rhKGF-2占總蛋白的25%，明顯優(yōu)于前者，重組蛋白均主要以可溶形式存在于超聲波破菌后的上清內(nèi)。pQE31-rhKGF-2經(jīng)誘導(dǎo)后幾乎沒有目的蛋白表達(dá)。

圖1 hKGF-2核酸序列的PCR擴(kuò)增

取表達(dá)上清，分別在4℃層析柜中過SP Sepha?rose Fastflow陽(yáng)離子交換柱，梯度NaCl溶液洗脫，收集穿過峰和各洗脫峰蛋白，進(jìn)行14%的SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)rhKGF-2在NaCl濃度為0.9 mol/L時(shí)被洗脫。取純化的目的蛋白進(jìn)行14%的SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色（圖3）和薄層掃描分析表明其純度在95%以上。取純化的重組蛋白，經(jīng)水透析后冰干保存。

2.3 rhKGF-2的抗原性和生物學(xué)活性檢測(cè)

取冰干保存的rhKGF-2，經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用脫脂奶粉封閉后進(jìn)行一抗、二抗孵育，曝光顯影。Western印跡結(jié)果（圖4）顯示，純化后的重組蛋白均能與KGF-2抗體結(jié)合，反應(yīng)條帶單一并與預(yù)期相對(duì)分子質(zhì)量一致，表明純化的重組蛋白具有較好的抗原活性。

用MTT法檢測(cè)rhKGF-2對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果（圖5）顯示，rhKGF-2在100 ng/mL的濃度下就能顯著促進(jìn)Hep-2細(xì)胞增殖，pET-24brhKGF-2與pBV220-rhKGF-2表達(dá)的重組蛋白在100～1000 ng/mL濃度范圍內(nèi)對(duì)Hep-2細(xì)胞的促增殖作用一致，兩者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無差異，且都顯示出明顯的濃度依賴特性。

3 討論

圖2 rhKGF-2原核表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

圖3 rhKGF-2經(jīng)SP純化的SDS-PAGE分析

KGF-2是具有多種功能的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，它可以加速外傷性創(chuàng)口的愈合，修復(fù)各種皮膚損傷且?guī)缀醪恍纬擅黠@瘢痕[4]。此外，還參與和調(diào)控胚胎組織和器官的形成與分化，在胚胎發(fā)育過程中起重要的調(diào)節(jié)作用[5]。利用基因工程技術(shù)獲得rhKGF-2具有廣泛的市場(chǎng)前景，但如何得到穩(wěn)定表達(dá)且表達(dá)量高的菌株，是進(jìn)行中試規(guī)?；a(chǎn)的前提。我們通過構(gòu) 建 pBV220-rhKGF-2、pET-24b-rhKGF-2和pQE31-rhKGF-2表達(dá)載體，比較了hKGF-2基因在不同原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)量與表達(dá)穩(wěn)定性之間的差異，以期獲得穩(wěn)定和高表達(dá)的菌株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pBV220-rhKGF-2的表達(dá)量占總蛋白的10%，而pET-24b-rhKGF-2的表達(dá)量占總蛋白的25%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)pET-24b-rhKGF-2的表達(dá)穩(wěn)定性明顯強(qiáng)于pBV220-rhKGF-2載體系統(tǒng)，兩者表達(dá)生成的重組蛋白都主要以可溶形式存在。pQE31-rhKGF-2經(jīng)誘導(dǎo)后幾乎沒有目的蛋白表達(dá)。pBV220表達(dá)載體為熱誘導(dǎo)機(jī)制，菌體的密度和溫度不易控制，可能會(huì)在大規(guī)模發(fā)酵過程中出現(xiàn)表達(dá)不穩(wěn)定現(xiàn)象；pQE31載體采用T5啟動(dòng)子，其對(duì)不同基因的表達(dá)效果差異明顯，對(duì)某一類蛋白不能生成重組蛋白；pET系列載體采用T7啟動(dòng)子，該載體系統(tǒng)是在大腸桿菌中克隆和表達(dá)重組蛋白的最強(qiáng)大系統(tǒng)，同時(shí)在規(guī)模生成過程中也易于控制，表達(dá)穩(wěn)定，表達(dá)量明顯優(yōu)于pBV220表達(dá)系統(tǒng)，這與某些實(shí)驗(yàn)結(jié)果[6]有所出入。我們還發(fā)現(xiàn)，利用不同的原核系統(tǒng)生成的重組蛋白在抗原性和生物活性方面沒有明顯差異。綜上，針對(duì)不同的重組蛋白，不同的表達(dá)載體和宿主菌及不同的誘導(dǎo)條件有明顯差異的表達(dá)效率和穩(wěn)定性。

圖4 純化的rhKGF-2的Western印跡

圖5 rhKGF-2對(duì)Hep-2細(xì)胞的促增殖作用

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