程然然，閆永紅，弓蒙蒙，曹培麗，賀福初,，王曉暉

1.北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京蛋白質(zhì)組研究中心 蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206

細(xì)胞分裂周期蛋白26（cell division cycle 26，CDC26）是細(xì)胞周期后期促進(jìn)復(fù)合物（cell cycle anaphase-promotingcomplex，APC）家 族 成 員 。CDC26基因是編碼泛素連接酶的基因之一，通過編碼細(xì)胞中泛素連接酶來調(diào)控細(xì)胞周期蛋白的合成與分解，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞周期性的分裂與增殖分化[1-2]。CDC26和APC6連接后，可以對細(xì)胞周期蛋白的降解產(chǎn)生作用[3]。

目前對CDC26基因的研究報道不多，大多都是對CDC25和CDC42基因所控制的其蛋白家族的研究[4-6]。RNA干擾（RNA interfering，RNAi）是近年發(fā)展迅速的一項(xiàng)生物技術(shù)，已成為基因功能研究和基因治療的強(qiáng)有力工具[7]。我們以短發(fā)夾RNA（short hair RNA，shRNA）腺病毒為介導(dǎo)，構(gòu)建靶向干擾CDC26基因的表達(dá)載體，為CDC26基因功能的研究提供相關(guān)技術(shù)手段和積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

人293A細(xì)胞株、HeLa細(xì)胞株、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）、大腸桿菌Top10菌株、穿梭載體pENTRY-EF1a-EGFP-Mir30、腺病毒載體pAd/pl-DEST均來自北京蛋白質(zhì)組研究中心分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室；DNA限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自NEB公司；Gateway體外重組系統(tǒng)、PEI轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol購自Invitrogen公司；DNA快速純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega公司；其他常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純級產(chǎn)品。

1.2 穿梭載體pENTRY-CDC26-shRNA的構(gòu)建和鑒定

參考小鼠CDC基因（GenBank：NM_139291.3）設(shè)計CDC26基因的靶向shRNA序列（TGCTGTTGACA GTGAGCGCAGCTCAAGCTCGACGACATTGTAGTGAAGCCACAGA TGTACAATGTCGTCGAGCTTGAGCTTTGCCTACTGCCTCGGA）及對照組shRNA序列（為GFP的靶向序列，命名為S000）（TGCTGTTGACAGTGAGCGAAACGTCTATATCATGGCCG ACTAGTGAAGCCACAGATGTAGTCGGCCATGATATAGACGTTGT GCCTACTGCCTCGGA）。

本研究避開了傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增靶向shRNA序列，而是依據(jù)DNA雙鏈互補(bǔ)性質(zhì)將目的序列分割合成，而后以退火連接的方式構(gòu)建其載體。CDC26序列拆分如下：

A：tcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgCAGCTCAAGCTCGACG ACATTG；B：ttcactaCAATGTCGTCGAGCTTGAGCTGcgctcactgtca acagcaatataccttc；C：tagtgaagccacagatgtaCAATGTCGTCGA GCTTGAGCTTtgcctactgcctcgg；D：aattccgaggcagtaggcaAAG CTCAAGCTCGACGACATTGtacatctgtggc。

S000對照組以同樣的方法拆分，由華大基因有限公司（北京）合成。A和B退火，C和D退火，退火產(chǎn)物直接暴露有XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，無須再次酶切。將2段退火產(chǎn)物與pENTRY-EF1a-EGFPMir30（XhoⅠ和EcoRⅠ酶切回收）載體用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素（Kan）抗性選擇陽性克隆，提質(zhì)粒，送華大基因有限公司進(jìn)行測序鑒定。

1.3 重組腺病毒載體pAd-CDC26-shRNA的構(gòu)建

將測序鑒定正確的pENTRY-CDC26-shRNA載體用Gateway體外重組系統(tǒng)重組到pAd/pl-DEST。Gateway反應(yīng)體系（10 μL）包括6 μL TE（pH8.0）、1 μL pENTRY-CDC26-shRNA（100 ng）、1 μL pAd-DEST（150 ng）、2 μL LRⅡ重組酶。室溫反應(yīng)1 h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，氨芐西林（Amp）抗性選擇陽性克隆，提取質(zhì)粒用EcoRⅠ酶切鑒定。

1.4 重組腺病毒的包裝與擴(kuò)增

將正確的重組子用PacⅠ酶切線性化，乙醇沉淀法回收，用PEI轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，24 h后觀察GFP的表達(dá)，培養(yǎng)7～10 d后在顯微鏡下觀察細(xì)胞空斑病變，當(dāng)細(xì)胞中出現(xiàn)病變且視野中局部或全部為綠色熒光時，表明重組腺病毒在293A細(xì)胞中包裝成功。當(dāng)部分細(xì)胞開始變圓并脫落時，收集細(xì)胞及其培養(yǎng)液，于-80℃與37℃反復(fù)凍融3次裂解細(xì)胞以釋放病毒顆粒，4000 r/min離心10 min，取上清于-80℃保存，將回收到的病毒原液感染新的293A細(xì)胞，擴(kuò)增病毒，回收備用。

1.5 病毒滴度的測定

準(zhǔn)備生長良好的HeLa細(xì)胞，消化計數(shù)稀釋至1×105/mL，加入6孔板，1 mL/孔；將3個稀釋度（10-2、10-3、10-4）的病毒加入6孔板，24 h后觀察病毒感染細(xì)胞的熒光數(shù)量[8]，利用流式細(xì)胞儀檢測病毒滴度。

1.6 CDC26 shRNA重組腺病毒在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及干擾效果鑒定

基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)液加10%胎牛血清（FBS）培養(yǎng)MEF，其密度達(dá)90%時用已知滴度的病毒液感染細(xì)胞，24 h后觀察GFP的表達(dá)情況，以確定重組腺病毒是否感染MEF。收集感染的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與對照組（S000）細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄形成cDNA。采用實(shí)時熒光定量PCR（qPCR）檢測CDC26基因mRNA的表達(dá)情況[9-10]。以β-actin為內(nèi)參，用NCBI Primer Blast設(shè)計各組的定量檢測引物CDC26-F（5'-TGCAGAGGCCTGAAAAGAGATTT-3'）、CDC26-R（5'-ACTCCTCAATGTCGTCGAGC-3'）、 β-ac?tin-F（5'-AACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3'）和 β-actin-R（5'-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3'）。用 2-ΔΔCt法進(jìn)行相對定量分析，檢測CDC26基因mRNA的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 穿梭質(zhì)粒pENTRY-CDC26-shRNA的克隆

將克隆好的CDC26與對照組S000入門質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，證實(shí)所設(shè)計的shRNA序列已正確插入pENTRY-EF1α-EGFP-Mir30載體。

2.2 重組腺病毒載體pAd-CDC26-shRNA的構(gòu)建

pAd-CDC26-shRNA載體經(jīng)EcoRⅠ酶切，結(jié)果與理論預(yù)期相符（圖1），表明成功構(gòu)建了腺病毒重組載體pAd-CDC26-shRNA。

2.3 重組腺病毒的包裝

帶有GFP標(biāo)記的線性化pAd-CDC26-shRNA及對照組pAd-S000-shRNA載體轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞8 d后，在顯微鏡下觀察到細(xì)胞病變，且GFP充滿視野中的絕大多數(shù)細(xì)胞，表明腺病毒包裝成功（圖2）。

2.4 病毒滴度測定結(jié)果

用流式細(xì)胞儀檢測3個濃度梯度的細(xì)胞熒光產(chǎn)生情況，結(jié)果見圖3，陰性對照組無熒光產(chǎn)生，其余3組（10-2、10-3、10-4）都產(chǎn)生了不同層次的熒光數(shù)目。假定每一個細(xì)胞內(nèi)只有一個病毒進(jìn)入，則根據(jù)公式及10-2管的病毒感染率可計算出病毒初液的滴度（UT/mL）=0.835×1.18×106×100/0.9=1.09×1010。

2.5 CDC26 shRNA重組腺病毒在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及干擾效果

用已知滴度的病毒感染3代以內(nèi)的MEF，24 h后在熒光顯微鏡下觀察，可見視野中有大量綠色熒光（圖4），說明重組腺病毒成功感染了MEF。收集各組細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測，結(jié)果表明熒光定量PCR引物具有很好的溶解曲線（圖5），表明PCR引物特異性良好。被感染了病毒的細(xì)胞其相應(yīng)的基因擴(kuò)增率僅為26.85%，可計算出設(shè)計和構(gòu)建的shRNA對細(xì)胞中CDC26基因的抑制率為73.14%（圖6），表明成功構(gòu)建了具有較高敲低效果的shRNA腺病毒載體。

2.6 CDC26 shRNA重組腺病毒在小鼠肝臟內(nèi)的干擾效果研究

用已知病毒滴度的腺病毒，尾靜脈注射6～8周雄性C57/BL6小鼠，1010/只，對照組和實(shí)驗(yàn)組各5只，注射1周后測量小鼠空腹血糖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照小鼠相比，注射CDC26 shRNA的小鼠的血糖值明顯降低（圖7），表明CDC26在小鼠體內(nèi)血糖的維持中起重要作用，同時暗示了CDC26在糖代謝過程中的重要作用。

3 討論

CDC26是APC家族中的一員，由位于小鼠4號染色體上的CDC26基因編碼，對調(diào)控細(xì)胞周期具有重要作用。目前有關(guān)APC家族的研究主要集中在CDC25和CDC42上[11]，對CDC26的研究報道較少。

圖1 pAd-CDC26-shRNA重組質(zhì)粒的酶切鑒定

圖2 重組腺病毒包裝過程中的細(xì)胞病變效應(yīng)及GFP表達(dá)（×40）

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測pAd-CDC26-shRNA重組腺病毒滴度

圖4 重組腺病毒感染MEF（×40）

圖5 實(shí)時熒光PCR引物特異性的溶解曲線

圖6 構(gòu)建的shRNA敲低CDC26 mRNA的RT-qPCR檢測結(jié)果

圖7 病毒注射7 d后C57/BL6小鼠的空腹血糖值

為了進(jìn)一步研究CDC26在細(xì)胞中可能發(fā)揮的作用，我們設(shè)計了CDC26基因的shRNA。鑒于腺病毒具有感染效率高、宿主廣泛、容易制備表達(dá)、不整合入染色體、表達(dá)效率高等優(yōu)點(diǎn)，我們選擇構(gòu)建CDC26基因的shRNA腺病毒載體。通過限制性內(nèi)切酶分析及堿基序列測定，證明構(gòu)建了重組腺病毒載體pAd-CDC26-shRNA。我們在293A細(xì)胞中包裝了重組腺病毒。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，感染pAd-CDC26-shRNA腺病毒的MEF中CDC26基因的mRNA表達(dá)明顯減少，證明靶向shRNA表達(dá)成功。我們還發(fā)現(xiàn)CDC26敲低后小鼠的血糖值會明顯降低。以上結(jié)果為下一步機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

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