桑本紅，徐曉津＊，毛勇，王軍，蘇永全

（1.集美大學 水產(chǎn)學院 福建省海洋漁業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，福建 廈門361021；2.廈門大學 海洋與地球?qū)W院，福建 廈門361005）

1 引言

大黃魚Lari michthyscrocea是我國主要海洋經(jīng)濟魚類之一，是我國養(yǎng)殖規(guī)模最大的海水魚類和我國八大優(yōu)勢出口養(yǎng)殖水產(chǎn)品之一［1］。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，各種傳染性疾病發(fā)生日益頻繁，嚴重制約大黃魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，其中由溶藻弧菌Vibrioal ginol yticus引起的弧菌病是養(yǎng)殖大黃魚最常見的傳染性疾病之一，其發(fā)病率和死亡率高，給大黃魚養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失［2］。

巨噬細胞移動抑制因子（MIF）是一種哺乳動物宿主炎癥反應不可缺少的組成成分［3］，能抑制巨噬細胞移動。Ber nhagen等發(fā)現(xiàn)，當垂體前葉細胞暴露于內(nèi)毒素脂多糖（LPS）后，就會釋放 MIF分子，表明MIF是聯(lián)系內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)的中介因子［4］。近年來，許多研究證明MIF在細胞增殖的調(diào)控、細胞凋亡以及生長因子的表達、惡性腫瘤的演進等方面起著重要的作用［5］。MIF還參與哺乳動物很多急性、慢性炎癥反應的發(fā)病機制，包括敗血癥、關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎、炎性腸炎和特異性皮炎等［6］。但是MIF的過度表達，會引起免疫系統(tǒng)功能紊亂，出現(xiàn)全身性炎癥反應綜合癥。

國內(nèi)外學者對人與動物的 MIF研究較多［7－8］，而魚類MIF的研究主要是關(guān)于大黃魚、斑馬魚、紅鰭東方鲀、黃鰭金槍魚等MIF基因的研究［9－12］，對MIF與魚炎癥關(guān)系的報道較少［7］。而已有研究表明，MIF在人及動物炎癥疾病組織中的表達水平遠遠超過正常組織［13］，MIF存在于多種器官的正常組織中，并參與多種疾病的病理形成過程，如動脈粥樣硬化、急性呼吸窘迫綜合癥及潰瘍性結(jié)腸炎等炎癥性疾?。?4］。說明MIF與炎癥疾病的發(fā)病機制有著密切的關(guān)系。本文采用免疫組化染色方法檢測MIF在大黃魚溶藻弧菌病組織和健康魚正常組織中的表達，探討其表達水平與病理特征的關(guān)系，為其應用于大黃魚弧菌病的預后判斷提供依據(jù)。對進一步尋找有效的預防、診斷和治療方法均具有重要意義。

2 材料與方法

2.1 材料

在福建省寧德市海鷗公司的海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖場，取體質(zhì)量約350～450 g的健康大黃魚200尾，分2組暫養(yǎng)于養(yǎng)殖池，每組100尾。每天換水1次，投餌2次，水溫24～25℃，暫養(yǎng)1周無異常后開始實驗。試驗菌株溶藻弧菌分離自患病大黃魚，經(jīng)回歸感染證明具有較強毒力［2］，于本實驗室－80℃保存。?。?0℃保存菌株接種于含2%NaCl的營養(yǎng)瓊脂斜面，28℃過夜培養(yǎng)，用滅菌生理鹽水洗脫菌苔，稀釋至2×107CFU／mL后用于感染實驗。大黃魚感染前用丁香酚麻醉，感染組每尾腹腔注射菌懸液0.2 mL，對照組每尾注射滅菌生理鹽水0.2 mL。感染7 d后分別從感染組取有典型病癥的大黃魚和從對照組隨機取大黃魚各6尾，取脾、肝、頭腎、腸組織，用10%甲醛溶液固定24 h。石蠟包埋，切片厚度為4μm。

2.2 方法

采用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶（S－P）法。大黃魚MIF多克隆抗體（由廈門大學海洋與地球?qū)W院實驗室提供）［13］，MIF一抗的稀釋濃度為1∶200。染色試劑盒SP－9001、濃縮性DAB試劑盒、兔超免二步法試劑為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。免疫組織化學染色方法見參考文獻［17］，操作步驟參照試劑盒說明書進行。常規(guī)脫蠟、水化，滴加5 ml 3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫下10 min；PBS沖洗，5 min×3次；0.5%BSA封閉1 h，滴加一抗（MIF），4℃，過夜，PBS沖洗，5 min×3次；滴加二抗，37℃孵育20 min；DAB顯色，10 min，室溫；PBS沖洗，5 min×3次；蘇木素復染，5 min，水沖洗；鹽酸酒精分化，水沖洗，酒精梯度脫水、二甲苯透明后，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。用已知陽性的溶藻弧菌病大黃魚組織作為MIF的陽性對照。

2.3 結(jié)果判斷

MIF陽性細胞主要定位于細胞質(zhì)，呈棕黃色染色為陽性細胞。每張切片高倍鏡下隨機選取10個視野共紀錄1 000個細胞，以染色強度結(jié)合陽性細胞數(shù)百分比綜合計分作半定量分析［4］。（1）按切片中細胞著色深淺評分：0分為細胞無顯色；1分為淡黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。（2）按陽性細胞數(shù)占同類細胞數(shù)的百分比評分：0%～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。每張切片隨機取5個400倍視野，每個視野均進行陽性細胞百分比計分與染色強度計分，再按這（1）、（2）兩項指標的積分相加將結(jié)果分為4級：0分為陰性（－），1～2分為弱陽性（＋），3～4分為中度陽性（＋＋），5～7分強陽性（＋＋＋）。

2.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包，采用四格表χ2檢驗進行分析，p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 MIF在溶藻弧菌病大黃魚組織中的表達

3.1.1 MIF在溶藻弧菌病大黃魚腸組織中的表達

MIF在健康大黃魚大腸組織中表達陰性（見圖1a）。感染溶藻弧菌患病大黃魚腸絨毛呈不整齊、模糊不清、崩解，腸壁黏膜下層及肌肉層結(jié)構(gòu)松散，出現(xiàn)許多空泡。MIF在患病大黃魚腸組織呈陽性表達，MIF在腸固有層、黏膜層與黏膜下層著色較強，棕黃色細顆粒較多（見圖1b、1c）。

3.1.2 MIF在溶藻弧菌病大黃魚脾組織中的表達

健康大黃魚脾組織MIF無表達（見圖1d）。感染溶藻弧菌患病大黃魚脾竇和脾索不清晰，分界不明顯，MIF在患病大黃魚脾組織中陽性表達，呈灶狀或彌漫性分布，以細胞質(zhì)為主，部分為胞膜著色，為棕黃色顆粒，陽性細胞在脾組織中的分布不均勻（見圖1e）。

3.1.3 MIF在溶藻弧菌病大黃魚頭腎組織中的表達

大黃魚頭腎無被膜，外周僅有一層膠原纖維包裹。頭腎實質(zhì)中無腎單位，屬于網(wǎng)狀淋巴組織。MIF在健康大黃魚大腸組織中不表達（見圖1f）。感染溶藻弧菌后，頭腎出現(xiàn)較多空泡。組織中可見大量的陽性細胞，而且染色強度為黃色至棕褐色，呈強陽性高表達（見圖1g、1h）。

3.2 大黃魚溶藻弧菌病各免疫器官MIF免疫組織化學比較研究

MIF在健康大黃魚頭腎、脾、腸各組織中均無表

達；MIF在感染溶藻弧菌患病大黃魚腸表達強陽性為49%，陽性率為56%（表1）。MIF在患病大黃魚脾表達強陽性為41%，陽性率為64%（表2）。MIF在患病大黃魚頭腎表達強陽性為89%，陽性率為92%（表3）。說明MIF在病魚頭腎中強陽性表達率最高，MIF在溶藻弧菌病大黃魚表達強度從弱到強依次是腸、脾、頭腎（表1、2、3）。

圖1 MIF在大黃魚各組織中的表達Fig.1 MIF immunohistochemistry in the healthy tissues and diseased tissues of Lari michthys crocea challenged with Vibrio al ginol yticus

表1 MIF在健康大黃魚與溶藻弧菌病大黃魚腸中的表達Tab.1 Synopsis of MIF reactivity in the intestines of Larimichthys crocea bet ween healthy and diseased fish

表2 MIF在健康大黃魚與溶藻弧菌病大黃魚脾中的表達Tab.2 Synopsis of MIF reactivity in the spleen of Larimichthys crocea bet ween healthy and diseased fish

表3 MIF在健康大黃魚與溶藻弧菌病大黃魚頭腎中的表達Tab.3 Synopsis of MIF reactivity in the head kidney of Larimichthys crocea between healthy and diseased fish

4 討論

巨噬細胞移動抑制因子（MIF）來源于垂體前葉［15］、外周的單核與巨噬細胞［16］，是一種含有115個氨基酸的蛋白質(zhì)，并且受下丘腦垂體控制的多功能性細胞因子。MIF作用較為廣泛，是炎癥介質(zhì)，MIF將巨噬細胞限制在異位灶處，并增強了巨噬細胞的分泌功能，能限制巨噬細胞在炎癥區(qū)域的移動，也能激活巨噬細胞，使其通過自身分泌和旁分泌作用分泌多種細胞因子，包括TNF－α、IL－1等，促進炎癥的發(fā)生發(fā)展，同時激活和趨化更多的巨噬細胞聚集［17］，增強其黏附、吞噬和抗腫瘤作用，又具有抑制巨噬細胞移動的特性，是重要的促炎癥反應介質(zhì)，在多種炎癥與自身免疫反應性疾病起著很重要的作用。MIF參與多種生理生化過程，如：炎癥反應、免疫應答、細胞增殖、血管生成以及腫瘤形成等過程。在炎癥反應和免疫調(diào)節(jié)中起重要作用［18］。

近年大黃魚炎癥疾病發(fā)病率增高，MIF與魚類炎癥疾病的關(guān)系如何，迄今未見文獻報道。本實驗以免疫組化法檢測MIF在溶藻弧菌病大黃魚頭腎、脾、腸等組織中的表達，結(jié)果表明MIF在健康對照組大黃魚組織中無表達；MIF在患病大黃魚頭腎、脾、腸強陽性表達分別為89%、41%、49%，提示MIF與魚炎癥疾病有關(guān)。目前有關(guān)MIF的研究主要集中在人與動物的惡性腫瘤方面［19－20］，對許多細胞分子的研究表明，MIF作為在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用的細胞因子，在胃炎、胃癌的發(fā)生發(fā)展中起了很重要的作用［21］。而一些體內(nèi)外實驗證明，幽門螺桿菌能誘導MIF表達增強，幽門螺桿菌陽性的胃黏膜上皮細胞、T細胞、單核細胞MIF表達陽性顯著高于幽門螺桿菌陰性者，單核細胞與幽門螺桿菌共同培養(yǎng)后單核細胞表達MIF陽性顯著增加，幽門螺桿菌感染與胃上皮及炎癥細胞MIF蛋白表達有關(guān)［21］，本研究結(jié)果中頭腎與脾作為大黃魚免疫器官，含有單核細胞等免疫細胞，MIF在溶藻弧菌病大黃魚免疫器官頭腎與脾中陽性表達率較高，高于在患病大黃魚中腸的表達，尤其在病魚頭腎中MIF陽性表達92%。MIF在患病大黃魚腸表達強度陽性率為56%，MIF在溶藻弧菌病大黃魚組織中表達強度從弱到強依次是腸、脾、頭腎。而健康大黃魚組織MIF表達陰性，同樣說明溶藻弧菌感染與魚炎癥細胞MIF蛋白表達有關(guān)。

而BESWICK等體外實驗證實幽門螺桿菌能通過Cag A刺激胃黏膜上皮細胞產(chǎn)生MIF，促進胃黏膜上皮細胞增殖，而用抗MIF抗體能阻滯胃上皮細胞增殖，提示MIF在幽門螺桿菌誘導的胃上皮細胞增殖中可能扮演重要的作用［22］。于曉輝等研究40例人胃癌組織中MIF陽性表達例數(shù)明顯高于正常胃黏膜［23］。與這些人與動物疾病組織中MIF表達研究報道相似，本研究結(jié)果表明MIF在健康大黃魚組織中無表達，在溶藻弧菌病大黃魚頭腎、脾、腸等組織病變中高表達。顯示MIF在大黃魚溶藻弧菌病發(fā)病中發(fā)揮某種重要作用，但具體的發(fā)病調(diào)控機制尚需進行進一步的研究和探討，而深入了解其作用機制可能為魚類炎癥疾病治療開辟新的途徑。

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