馬登磊 邵建群 何深知 張 楓*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)化學(xué)生物學(xué)與藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，北京100069;2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室，北京100053)

元寶楓(Acer truncatum Bunge)又叫五角楓，屬槭樹科槭樹屬落葉喬木，是中國特有的樹種。元寶楓葉中含有黃酮、多酚、綠原酸等多種化學(xué)成分［1-3］，而黃酮類物質(zhì)是其重要的活性成分之一。近年來的研究［4-5］顯示，不僅元寶楓葉提取物中黃酮類物質(zhì)具有較強(qiáng)的自由基清除能力和抗氧化性，而且還對(duì)治療肥胖的潛在靶點(diǎn)脂肪酸合酶有較強(qiáng)的抑制作用［6－7］，因而研究元寶楓葉黃酮類物質(zhì)的測(cè)定方法是非常必要的。

目前分析測(cè)定黃酮的方法有紫外分光光度法和高效液相色譜法［8-10］。高效液相色譜法雖然精度高，但適用于黃酮單體的定量分析，而總黃酮含量的測(cè)定主要采用紫外分光光度法?，F(xiàn)有的研究［11-12］顯示，用硝酸鋁紫外分光光度法測(cè)定總黃酮時(shí)，綠原酸的存在可能對(duì)結(jié)果有干擾，因鄰二酚類結(jié)構(gòu)與Al3+形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，并使測(cè)定的總黃酮含量偏高。由于元寶楓葉提取物中除含有黃酮，還含有綠原酸等其他物質(zhì)，所以必須設(shè)法降低綠原酸對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾。根據(jù)黃酮類化合物能與鋁離子形成穩(wěn)定的熒光絡(luò)合物的特性，本文采用了熒光分析法并對(duì)測(cè)定元寶楓葉中的總黃酮含量進(jìn)行了多方面的實(shí)驗(yàn)，希望本研究所建立的方法能為元寶楓葉中總黃酮含量測(cè)定提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器

F-2500型熒光分光光度計(jì)(日本島津公司);TGL-16型高速臺(tái)式離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠);KQ-50B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);石英比色皿(宜興市晶科光學(xué)儀器有限公司);BT25S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2 材料

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，0080－9705);綠原酸標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品(中國藥品生物制品鑒定所，110753－200212)。分析純?cè)噭┯腥弦宜徕c(西隴化工股份有限公司);硝酸鋁(北京現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品有限公司);無水乙酸(北京化工廠)，無水乙醇(北京化工廠)。水為蒸餾水，元寶楓落葉采自陜西楊陵(粉碎機(jī)磨碎并過40目篩)。

1.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取蘆丁對(duì)照品10 mg于50 mL容量瓶中，用60%的乙醇溶解定容，準(zhǔn)確吸取此溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，加入5%的Al(NO3)3溶液1 mL，pH=5的醋酸-醋酸鈉緩沖液3 mL。用60%乙醇定容，搖勻，即配成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 樣品溶液的制備

稱取元寶楓葉細(xì)粉1g于錐形瓶中，加入60%乙醇30 mL，室溫條件下超聲提取30 min，然后12 000 r/min離心6 min。取上清液置于另一個(gè)錐形瓶中，室溫避光保存，此為元寶楓葉提取液的樣品溶液。

測(cè)定時(shí)，吸取100 μL樣品溶液，置于10 mL容量瓶中，加入5%的Al(NO3)3溶液1 mL，pH=5的醋酸－醋酸鈉緩沖液3 mL。用60%乙醇定容，搖勻，即配成樣品工作溶液。

1.5 總黃酮含量測(cè)定

在激發(fā)光譜通帶寬度5 nm，發(fā)射光譜通帶寬度5 nm，激發(fā)波長λ=470 nm，發(fā)射波長λ=547 nm的條件下，測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度對(duì)相應(yīng)的濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在相同的條件下測(cè)定樣品溶液的熒光強(qiáng)度，再根據(jù)回歸方程求出含量。同時(shí)，按選定的實(shí)驗(yàn)方法即60%乙醇為溶劑，加入1 mL 5%Al(NO3)3，調(diào)樣品溶液 pH=5，對(duì)樣品溶液進(jìn)行了相關(guān)的方法學(xué)考察研究。

2 結(jié)果

2.1 熒光化合物的激發(fā)和發(fā)射光譜

按照實(shí)驗(yàn)方法選擇光譜通帶寬度5 nm，對(duì)蘆丁溶液的激發(fā)和發(fā)射光譜進(jìn)行掃描。考慮到綠原酸對(duì)熒光的影響，本實(shí)驗(yàn)本著盡量避開綠原酸的影響并且保證獲得較好的發(fā)射光譜的原則，選擇的激發(fā)和發(fā)射波長為470 nm和547 nm。

2.2 測(cè)定條件的選擇

2.2.1 溶劑濃度的影響

黃酮類化合物難溶于水，易溶于有機(jī)溶劑。本實(shí)驗(yàn)選擇常用于植物中黃酮提取的乙醇作為溶劑，并考察不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。圖1為加入5%硝酸鋁溶液1 mL，pH=5的測(cè)定結(jié)果，此圖表明乙醇的體積分?jǐn)?shù)越大，蘆丁的熒光強(qiáng)度越大?？紤]到乙醇體積分?jǐn)?shù)越大，揮發(fā)性越大，實(shí)驗(yàn)操作中對(duì)測(cè)定產(chǎn)生影響也會(huì)變大，本實(shí)驗(yàn)選擇了60%乙醇溶液作為溶劑。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.1 Effects of different ethanol concentration on the fluorescence intensity

2.2.2 Al(NO3)3加入量的影響

黃酮類化合物與鋁離子可生成穩(wěn)定的熒光配合物，Al(NO3)3的用量可對(duì)熒光強(qiáng)度造成影響。在10 mL的容量瓶中，加入一定質(zhì)量濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入 5%Al(NO3)3溶液為 0、0.5、1、1.5、2、3 mL，以60%的乙醇為溶劑，pH=5時(shí)測(cè)定各溶液的熒光強(qiáng)度值，圖2的結(jié)果表明，當(dāng)5%Al(NO3)3溶液用量為0.5 mL和1 mL時(shí)熒光強(qiáng)度較大。本實(shí)驗(yàn)選擇采用加入5%Al(NO3)3為1 mL。

圖2 5%硝酸鋁溶液用量對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effects of dosage of 5%Al(NO3)3 solution on the fluorescence intensity

2.2.3 溶液pH值的影響

不同酸度的溶液會(huì)對(duì)黃酮類化合物與鋁離子生成配合物的穩(wěn)定性，以及熒光強(qiáng)度產(chǎn)生影響。以60%的乙醇為溶劑，加入5%硝酸鋁溶液1 mL，采用醋酸－ 醋酸鈉為緩沖液，配制 pH 值分別為2、3、4、4.5、5、6的蘆丁測(cè)定溶液，并進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)定。根據(jù)圖3結(jié)果，隨著pH值的增加，熒光強(qiáng)度也在增大。由于pH=6時(shí)測(cè)定溶液中有沉淀出現(xiàn)，故實(shí)驗(yàn)選擇pH=5作為測(cè)定溶液的酸度，即在10 mL中加入pH=5的醋酸－醋酸鈉緩沖液3 mL。

圖3 溶液pH值對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effects of the solution acidity on the fluorescence intensity

2.2.4 放置時(shí)間的影響

在上述實(shí)驗(yàn)條件下，將蘆丁的測(cè)定溶液靜置于室內(nèi)，并避免陽光直射。在不同時(shí)間測(cè)定溶液的熒光強(qiáng)度。由圖4可知，在靜置120 min內(nèi)熒光強(qiáng)度變化不大，這說明在本實(shí)驗(yàn)條件下所配制的溶液很穩(wěn)定。考慮到實(shí)驗(yàn)方法的一致性，選擇放置30 min后測(cè)定熒光強(qiáng)度。

圖4 靜置時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effects of standing time on fluorescence intensity

2.2.5 綠原酸的影響

元寶楓葉提取物中含有綠原酸，綠原酸為3－咖啡?？崴幔肿咏Y(jié)構(gòu)中含有鄰二酚羥基，也可與Al3+形成配合物而發(fā)出熒光，從而對(duì)黃酮含量的測(cè)定產(chǎn)生影響。為了考察綠原酸對(duì)黃酮測(cè)定的影響，選擇不同的激發(fā)波長，對(duì)樣品中加入不同質(zhì)量濃度的綠原酸進(jìn)行對(duì)比分析研究。

表1中的第1組數(shù)據(jù)是未加綠原酸的樣品溶液熒光強(qiáng)度值，ΔF值分別是第2、3組加綠原酸與第1組未加綠原酸熒光強(qiáng)度數(shù)值的差值。從表1可以看出，在元寶楓葉提取物的樣品溶液中加入綠原酸之后，其熒光強(qiáng)度會(huì)變大。為了盡可能減少綠原酸的影響，并確保測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)選擇了ΔF值變化相對(duì)較小的470 nm為激發(fā)波長。

由于綠原酸的存在，是可能導(dǎo)致對(duì)元寶楓葉提取物中總黃酮含量測(cè)定結(jié)果偏高的原因，圖5和圖6分別為綠原酸與Al3+結(jié)合后，在λem=547 nm掃描的激發(fā)光譜和在λex=470 nm掃描的熒光光譜(發(fā)射光譜)。從圖5的激發(fā)光譜圖可以看到，激發(fā)波長需要大于450 nm，才可以降低綠原酸在547 nm處的熒光強(qiáng)度。圖6的熒光光譜圖可知，在波長大于490 nm的范圍內(nèi)，綠原酸與Al3+結(jié)合所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度已很低。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢出限

實(shí)驗(yàn)表明，蘆丁質(zhì)量濃度在6.55×10－6mol/L～3.20×10－5mol/L的范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度具有良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為:y=1.147 7x+0.430 4，

表1 綠原酸對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Tab.1 Effects of chlorogenic acid on fluorescence intensity

式中:y表示熒光強(qiáng)度，x表示蘆丁的質(zhì)量濃度(μg/mL)，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 1。對(duì)空白對(duì)照液進(jìn)行11次平行測(cè)定，根據(jù)公式CL=3S/K計(jì)算，方法檢出限為1.36×10－7mol/L。

圖5 綠原酸在λem=547 nm處的激發(fā)光譜Fig.5 Excitation spectrum of chlorogenic acid at λem=547 nm

圖6 綠原酸在λex=470 nm的熒光(發(fā)射)光譜Fig.6 Fluorescence(emission)spectrum of chlorogenic acid at λex=470 nm

2.4 樣品測(cè)定及回收率實(shí)驗(yàn)

按選定的實(shí)驗(yàn)方法，測(cè)定了元寶楓葉提取物中總黃酮的含量，并對(duì)樣品溶液進(jìn)行了平行測(cè)定(n=5)，結(jié)果見表2。為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，在樣品溶液中加入蘆丁對(duì)照品進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 元寶楓葉中總黃酮含量Tab.2 Contents of total flavonoid in the leaves of Acer truncatum Bunge (n=5)

表3 樣品回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of the recovery test of samples (n=5)

3 結(jié)論

本文采用熒光分析方法，測(cè)定元寶楓葉中總黃酮的含量。分別考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、5%Al(NO3)3的加入量、pH大小、放置時(shí)間以及綠原酸對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。由于綠原酸的存在，是可能導(dǎo)致對(duì)元寶楓葉提取物中總黃酮含量測(cè)定結(jié)果偏高的原因。故本實(shí)驗(yàn)通過改變激發(fā)波長，從而減小綠原酸產(chǎn)生的熒光，進(jìn)而減弱其對(duì)測(cè)定的影響。實(shí)驗(yàn)表明蘆丁質(zhì)量濃度在6.55×10－6mol/L～3.20×10－5mol/L與熒光強(qiáng)度具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為 y=1.147 7x+0.430 4，R2=0.999 1，檢出限為1.36 ×10－7mol/L。

由于熒光分析法相對(duì)于紫外－可見分光光度法靈敏度高，而且本研究方法在穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度和精密度方面符合要求，實(shí)驗(yàn)操作方法簡便易行。因此，可以作為測(cè)定元寶楓葉總黃酮含量的參考方法。

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