張志麗 陳兵剛 姜太一 喬錄新 吳 昊 陳德喜 張玉林*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院感染中心，北京100069;2.山東省濱州市中心醫(yī)院感染內(nèi)科，山東濱州251700;3.北京市肝病研究所，北京100069)

在高活性抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy，HAART)時(shí)代，人類免疫缺陷病毒-1(human immunodeficiency virus-1，HIV-1)相關(guān)慢性合并癥——HIV-1相關(guān)神經(jīng)損傷(HIV-1 associated neurological impairment，HANI)逐漸顯現(xiàn)，成為影響患者生活質(zhì)量和預(yù)后的重要危險(xiǎn)因素［1］。HANI發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚。一般認(rèn)為可能與HIV病毒感染所引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)炎性反應(yīng)有關(guān)。其核心是HIV首先通過CCR5(C-C chemokine receptor 5)和CXCR4(C-X-C chemokine receptor 4)受體于外周感染單核/巨噬細(xì)胞，由其攜帶病毒損傷并透過血-腦脊液屏障(blood brain barrier，BBB)進(jìn)入CNS，定植或感染其中的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，從而導(dǎo)致局部炎性反應(yīng)，表現(xiàn)為炎性反應(yīng)細(xì)胞激活、細(xì)胞因子和趨化因子分泌增加以及病毒顆粒(包括病毒膜蛋白gp120)的釋放和氧化應(yīng)激反應(yīng)等，最終使得神經(jīng)元功能障礙及凋亡，累積發(fā)生神經(jīng)認(rèn)知損傷(neurocognitive impairment，NCI)［2-4］。本研究擬通過原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，體外觀察HIV-1包膜蛋白gp120神經(jīng)毒性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

Balb/C小鼠購自中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院〔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號:SYXK(京)2009－0020〕;重組gp120 V3環(huán)多肽購自北京Sino生物公司;D-Glucose、β-actin單克隆抗體購自Sigma公司(美國);神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基Neurobasal、B27、青鏈霉素、1 × Hanks液、青/鏈霉素、Glutamax購自Gibco公司(美國);CytoTox96非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自Promega公司(美國);抗微管蛋白2(MAP-2)抗體、抗bcl-2單克隆抗體購自Santa Cruz公司(美國);兔抗bax多克隆抗體購自Abcam公司(英國);Cy3標(biāo)記兔抗小鼠IgG購自BioLegend公司(加拿大);牛血清白蛋白(BSA)、原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(TUNEL)購自羅氏公司(美國);辣根過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠和抗兔二抗購自Jackson公司(美國);其他相關(guān)分析純試劑購自國內(nèi)生產(chǎn)公司。

1.2 原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)和gp120 V3環(huán)神經(jīng)毒性試驗(yàn)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作規(guī)范執(zhí)行。取孕16 d后balb/C胎鼠腦組織，在顯微鏡下于低溫解剖分離液(1×Hanks平衡鹽溶液+2.5 mmol/L Hepes+30 mmol/L D-Glucose+2 mmol/L CaCl2+0.5 mmol/L MgSO4+2 mmol/L NaHCO3+0.03%BSA+1%青/鏈霉素)中剝除硬腦膜，分離出大腦皮質(zhì)。解剖分離液清洗2遍后輕柔吹打，200目篩網(wǎng)過濾后，1 500 r/min離心3 min，棄上清液，加神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液(Neurobasal+1×Glutamax+2%B27+1%青/鏈霉素)，接種入右旋多聚賴氨酸包被的細(xì)胞培養(yǎng)板。對于預(yù)加蓋玻片的培養(yǎng)板，預(yù)先依次將蓋玻片在100%丙酮中洗滌40 min，無水乙醇洗滌20 min，0.1 mol/L鹽酸洗滌40 min，蒸餾水洗滌10 min，高壓滅菌25 min;然后將蓋玻片放入培養(yǎng)板孔中經(jīng)由右旋多聚賴氨酸包被后使用。每孔分別加培養(yǎng)液0.5 mL(24孔板)、1 mL(12孔板)和2 mL(6孔板)。細(xì)胞接種濃度分別為每孔2.5×105(24孔板)、5.0×105(12孔板)和12×105(6孔板)，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05 CO2恒溫培養(yǎng)箱溫育，每3 d更換一半培養(yǎng)液。依據(jù)既往文獻(xiàn)［5］說明，于神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)第7天，分別向培養(yǎng)基中加入 0、200、500、1 000 pmol/L重組gp120蛋白，37℃下孵育24 h，進(jìn)行神經(jīng)毒性試驗(yàn)。以上實(shí)驗(yàn)都在超凈臺(tái)內(nèi)無菌條件下進(jìn)行，相同條件重復(fù)3次，且繼續(xù)以下實(shí)驗(yàn)。

1.3 神經(jīng)細(xì)胞毒性及凋亡檢測

通過FITC熒光標(biāo)記的TUNEL檢測試劑盒評估細(xì)胞凋亡:4%多聚甲醛固定細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液沖洗后按TUNEL檢測試劑盒說明書操作，DAPI染色觀察細(xì)胞核形態(tài)。同時(shí)，通過測定培養(yǎng)基中的乳酸脫氫酶(LDH)來定量評估gp120的細(xì)胞毒性，培養(yǎng)基中LDH值越高則細(xì)胞凋亡/死亡比例就越高。按照商用乳酸脫氫酶試劑盒CytoTox96廠家說明書操作，簡言之，收集神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基與反應(yīng)底物各50 μL加入96孔板中室溫孵育30 min，再加終止液使反應(yīng)停止，通過Emax精密酶標(biāo)儀(Molecular Devices)測定490 nm波長下樣本的吸光度。設(shè)定純神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基為陰性對照(0%死亡)，加入裂解液后細(xì)胞完全裂解的培養(yǎng)基為陽性對照(100%死亡)，每樣本測量3次取平均值。檢測樣本死亡細(xì)胞比例(%)=［(檢測樣本吸光度－陰性對照吸光度)/(陽性對照吸光度－陰性對照吸光度)］×100%。

1.4 神經(jīng)突起測量

通過抗MAP-2單克隆抗體免疫熒光顯像觀察神經(jīng)突起形態(tài)學(xué)變化，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下:4%多聚甲醛室溫固定15 min;1×PBS洗滌15 min;1%Triton穿孔15 min;1×PBS洗滌15 min×2次;1%BSA+2%羊血清+1×PBS 37℃封閉1 h;1∶1 000濃度MAP-2單克隆抗體(封閉液稀釋)4℃過夜;1×PBS洗滌15 min×3次;1∶1 000濃度Cy3標(biāo)記抗小鼠二抗(封閉液稀釋)37℃溫育1 h;1×PBS洗滌20 min×3次;DAPI封片后于德國Leicadm500b型正向熒光顯微鏡下閱片并攝片(每個(gè)點(diǎn)至少選取3個(gè)視野，取平均數(shù));使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析神經(jīng)元突起數(shù)量和長度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

細(xì)胞計(jì)數(shù)、神經(jīng)元突起長度分析使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件。使用PASW statistics 18統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，且給出雙側(cè)95%可信區(qū)間，組間比較采用單因素方差分析和多重均數(shù)比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 gp120可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡

HIV包膜蛋白gp120能夠通過V3環(huán)與神經(jīng)元表面表達(dá)的趨化因子受體CCR5、CXCR4相互作用，直接或間接誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中，神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)第8 天，向培養(yǎng)基中加入 0、200、500、1 000 pmol/L 重組gp120 V3環(huán)多肽37℃孵育24 h。TUNEL檢測顯示隨著gp120 V3環(huán)重組蛋白濃度增加，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加(圖1A)。通過培養(yǎng)基LDH檢測得出的不同濃度V3環(huán)細(xì)胞毒性所致細(xì)胞死亡比例分別為:(21.16±3.56)%(對照組)、(35.23 ±10.42)%(200 pmol/L組)、(57.45±9.26)%(500 pmol/L 組)、(62.21±14.35)%(1 000 pmol/L組)，除了500 pmol/L組與1 000 pmol/L組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P＞0.05)，其余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(圖1B)。

圖1 gp120神經(jīng)細(xì)胞毒性Fig.1 HIV-1 envelope protein gp120 induced neuronal apoptosis

2.2 gp120可抑制神經(jīng)突起形成

本實(shí)驗(yàn)中通過免疫熒光Cy3標(biāo)記的抗神經(jīng)纖維特異性MAP-2抗體檢測gp120 V3環(huán)對神經(jīng)突起造成的損傷(圖2A)。對照組、200 pmol/L組、500 pmol/L組和1 000 pmol/L組平均每個(gè)神經(jīng)元突起數(shù)量分別為6.26±2.12、4.85±1.68、4.23±1.08和 3.81±0.86，除200 pmol/L組與500 pmol/L組，500 pmol/L組與1 000 pmol/L組外(P＞0.05)，其余各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖2B)。各組平均神經(jīng)突起長度為(900.24±169.06)μm(對照組)、(679.32±157.37)μm(200 pmol/L 組)、(445.64 ±56.13)μm(500 pmol/L組)和(173.39±29.58)μm(1 000 pmol/L組)。神經(jīng)突起長度隨gp120濃度增加而縮短(P＜0.01)(圖2C)。因此，HIV包膜蛋白gp120不僅誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，還會(huì)抑制神經(jīng)突起形成。

圖2 gp120抑制神經(jīng)突起形成Fig.2 HIV-1 envelope protein gp120 inhibited neurite outgrowth

2.3 gp120 V3環(huán)的神經(jīng)毒性與bcl-2低表達(dá)有關(guān)

Gp120誘導(dǎo)bcl-2蛋白低表達(dá)，但對bax蛋白低表達(dá)無影響(圖3)?？梢奼p120 V3環(huán)通過抑制bcl-2表達(dá)來誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

圖3 蛋白印跡檢測不同條件下凋亡調(diào)控蛋白bcl-2與bax蛋白表達(dá)水平的變化Fig.3 The change of bcl-2 and bax protein expression under different experimental conditions via Western blotting

3 討論

HIV相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知障礙與感染HIV的單核細(xì)胞透過血-腦脊液屏障，在CNS產(chǎn)生炎性反應(yīng)有關(guān)［6］。除了受HIV感染的炎性反應(yīng)(單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和膠質(zhì)細(xì)胞)細(xì)胞釋放的各種炎性介質(zhì)外，感染的炎性反應(yīng)細(xì)胞還可以釋放HIV-1相關(guān)蛋白，繼而產(chǎn)生病毒蛋白相關(guān)的興奮性神經(jīng)毒性，導(dǎo)致癥狀輕重不等的神經(jīng)認(rèn)知障礙［7-8］。HIV病毒調(diào)控元件包括長末端重復(fù)序列(long terminal repeat，LTR)、基因編碼的病毒蛋白Tat、Vpr、Nef和膜基因編碼的包膜蛋白 gp120與gp41 等［9］。

本研究發(fā)現(xiàn)gp120除了能夠誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡外，還能影響神經(jīng)突起的發(fā)育和生長，表明gp120在誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡之前可能已經(jīng)抑制神經(jīng)突觸傳遞，從而影響神經(jīng)元功能［10-11］。與神經(jīng)細(xì)胞凋亡相比，gp120或其他病毒蛋白對神經(jīng)軸突與樹突的損傷性抑制，對于無癥狀性和輕度神經(jīng)認(rèn)知障礙的發(fā)生可能更為重要［12-13］。除了誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡外，有研究［14-15］報(bào)道gp120還可通過蛋白激酶C途徑以及受體介導(dǎo)的Ca2+釋放，改變?nèi)四X微血管內(nèi)皮細(xì)胞中緊密連接蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞骨架的改變、單核細(xì)胞內(nèi)移增加。多項(xiàng)研究［16-18］證明gp120擾亂神經(jīng)細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)、破壞線粒體膜完整性，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放、激活caspase和核酸內(nèi)切酶，而gp120對神經(jīng)元鈣穩(wěn)態(tài)的破壞是通過干擾質(zhì)膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣調(diào)控系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)的［19-20］。

Bcl-2家族蛋白通過調(diào)控線粒體外膜的透化作用，使神經(jīng)細(xì)胞暴露于多種不同的促死亡信號［21］。Bcl-2家族中主要抗凋亡成員Bcl-2的表達(dá)會(huì)降低線粒體外膜的透化作用，以及線粒體死亡誘導(dǎo)因子如Ca2+及細(xì)胞色素C向胞質(zhì)的釋放［22］。而bcl-2家族中主要促凋亡成員bax的表達(dá)作用相反。因此，線粒體膜的透化作用是gp120誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的通路。本研究發(fā)現(xiàn)，重組人gp120 V3環(huán)多肽可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡和抑制神經(jīng)突起形成，并呈濃度依賴性。同時(shí)，gp120 V3環(huán)誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡與抑制bcl-2表達(dá)有關(guān)。

［1］Heaton R K，Clifford D B，F(xiàn)ranklin D R Jr，et al.HIV-associated neurocognitive disorders persist in the era of potent antiretroviral therapy:CHARTER Study［J］.Neurology，2010，75(23):2087-2096.

［2］Wu D T，Woodman S E，Weiss J M，et al.Mechanisms of leukocyte trafficking into the CNS［J］.J Neurovirol，2000，6 Suppl 1:S82-85.

［3］Gras G，Kaul M.Molecular mechanisms of neuroinvasion by monocytes-macrophages in HIV-1 infection［J］.Retrovirology，2010，7:30.

［4］Wang H，Sun J，Goldstein H.Human immunodeficiency virus type 1 infection increases the in vivo capacity of peripheral monocytes to cross the blood-brain barrier into the brain and the in vivo sensitivity of the blood-brain barrier to disruption by lipopolysaccharide［J］.J Virol，2008，82(15):7591-7600.

［5］Meucci O，Miller R J.gp120-induced neurotoxicity in hippocampal pyramidal neuron cultures:protective action of TGF-beta1［J］.J Neurosci，1996，16(13):4080-4088.

［6］丁渭，張玉林，喬錄新，等.氧化損傷在HIV相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知損害中的作用［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，33(5):602-609.

［7］Cicala C，Arthos J.Virion attachment and entry:HIV gp120 env biotinylation，gp120 Env，or integrin ligandbinding assay［J］.Methods Mol Biol，2014，1087:3-12.

［8］Tuzer F，Madani N，Kamanna K，et al.HIV-1 Env gp120 structural determinants for peptide triazole dual receptor site antagonism［J］.Proteins，2013，81(2):271-290.

［9］Roberts A J，Maung R，Sejbuk N E，et al.Alteration of methamphetamine-induced stereotypic behaviour in transgenic mice expressing HIV-1 envelope protein gp120［J］.J Neurosci Methods，2010，186(2):222-225.

［10］張紅梅，孫玉，柳雅立，等.gp120轉(zhuǎn)基因小鼠制備及初步鑒定［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，31(6):695-700.

［11］蓋祥云，趙瑛，劉琳，等.腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡致血管性癡呆的研究進(jìn)展［J］.中國腦血管病雜志，2010，7(11):614-616.

［12］Sarkar R，Mitra D，Chakrabarti S.HIV-1 Gp120 protein downregulates nef induced IL-6 release in immature dentritic cells through interplay of DC-SIGN［J］.PLoS One，2013，8(3):e59073.

［13］焦艷梅，吳昊.HIV-1潛伏庫研究進(jìn)展［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，30(5):639-642.

［14］Kanmogne G D，Schall K，Leibhart J，et al.HIV-1 gp120 compromises blood-brain barrier integrity and enhances monocyte migration across blood-brain barrier:implication for viral neuropathogenesis［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2007，27(1):123-134.

［15］Tintori C，Selvaraj M，Badia R，et al.Computational studies identifying entry inhibitor scaffolds targeting the Phe43 cavity of HIV-1 gp120［J］.Chem Med Chem，2013，8(3):475-483.

［16］Li W，Galey D，Mattson M P，et al.Molecular and cellular mechanisms of neuronal cell death in HIV dementia［J］.Neurotox Res，2005，8(1-2):119-134.

［17］Mattson M P，Haughey N J，Nath A.Cell death in HIV dementia［J］.Cell Death Differ，2005，12 Suppl 1:893-904.

［18］Shah A，Kumar S，Simon S D，et al.HIV gp120-and methamphetamine-mediated oxidative stress induces astrocyte apoptosis via cytochrome P450 2E1［J］.Cell Death Dis，2013，4:e850.

［19］Haughey N J，Mattson M P.Calcium dysregulation and neuronal apoptosis by the HIV-1 proteins Tat and gp120［J］.J Acquir Immune Defic Syndr，2002，31 Suppl 2:S55-61.

［20］Scharf L，West A P Jr，Gao H，et al.Structural basis for HIV-1 gp120 recognition by a germ-line version of a broadly neutralizing antibody［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2013，110(15):6049-6054.

［21］Adams J M，Cory S.The Bcl-2 apoptotic switch in cancer development and therapy［J］.Oncogene，2007，26(9):1324-1337.

［22］Ow Y P，Green D R，Hao Z，et al.Cytochrome c:functions beyond respiration［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9(7):532-542.