馬立坤，葉 鵬，鄧 江，黃文良，田仁元，呂雪峰

（遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院骨科，貴州 遵義 563000）

理想的骨組織工程支架材料首先應(yīng)具備良好的生物相容性，合適的孔徑及生物降解性［1，2］。絲素蛋白（silk fibroin，SF）、殼聚糖（chitosan，CS）、納米羥基磷灰石（nano Hydroxyapatite，HA）均是天然生物材料，具有無毒、良好的生物相容性及降解性［3～5］，分別在骨組織工程材料的應(yīng)用研究中取得一定的成果。而單但獨(dú)使用時(shí)都存在一些不足。前期實(shí)驗(yàn)將三者按1∶1∶1比例混合制備出SF／CS／n－HA生物支架，在考察其理化特性及表征的基礎(chǔ)上得出三者材料混合比單獨(dú)應(yīng)用更合符骨組織工程要求［6］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我復(fù)制及向成骨細(xì)胞定向分化潛能而成為骨組織工程的理想種子細(xì)胞之一［7］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用支架與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)通過MTT法及電鏡檢測(cè)其材料毒性。

1 材料與儀器

1.1 試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清（Hyelone公司）；MTT（Amresco公司）；DMSO（Amresco公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國）；離心機(jī)（Thermo美國），倒置顯微鏡（奧林巴斯，日本）；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰有限公司）；掃描電鏡（日立S－3400N，日本）；50萬居里60CO輻照裝置（貴州金農(nóng)輻照科技有限公司）。

1.2 動(dòng)物 新西蘭大白兔，清潔級(jí)，1月齡，購于第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（渝）2012－0003；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（渝）2012－0002。實(shí)驗(yàn)過程參照2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)意見》對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行處置［8］。

2 方法

2.1 SF／CS／n－HA生物三維支架制備 將SF、CS、n－HA按1∶1∶1比例混合，采用冷凍干燥法制備出SF／CS／n－HA生物三維支架，并通過3000Gy60Co照射滅菌后保存?zhèn)溆茫?］。經(jīng)檢測(cè)平均孔徑為85.67μm，孔隙率91.25%±2.35%。

2.2 兔骨髓間充質(zhì)細(xì)胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells.BMSCs）分離培養(yǎng) 取新西蘭大白兔，麻醉后消毒鋪巾，取出雙側(cè)股骨，除去肌肉，PBS清洗。膠骨鉗咬除兩端骨骺，用Hanks液（含肝素抗凝）沖出骨髓，然后用200目過濾篩過濾。1000轉(zhuǎn)／min離心5min，用含10%牛血清蛋白（FBS）低糖DMEM培養(yǎng)液反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶，放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48小時(shí)半換液，72小時(shí)小時(shí)全換液，以后視情況每隔兩三天換液，待細(xì)胞生長至80%～85%時(shí)，用胰蛋白酶消化，按1：2進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同原代。

2.3 支架體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 按培養(yǎng)基與支架體積比1ml／cm3為100%，37℃ 培養(yǎng)箱中浸提24小時(shí)，分別制備出濃度為100%、50%、25%浸提液。取第三代BMSCs，以細(xì)胞濃度為1×108／L每孔100μl接種到96孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后棄原培養(yǎng)基，更換為各濃度組浸提液，以加入完全基為陰性對(duì)照組，繼續(xù)細(xì)胞箱中培養(yǎng)，分別于24、48、72h隨機(jī)取一孔板，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力。依據(jù)ISO10993.5－1999及 GB／T16886.5－2003標(biāo)準(zhǔn)，按下式計(jì)算出相對(duì)增殖率并評(píng)價(jià)支架的細(xì)胞毒性［9，10］。支架細(xì)胞毒性相對(duì)增殖率（RGR）＝各濃度實(shí)驗(yàn)組吸光值／陰性對(duì)照組吸光值×100%。

2.4 支架細(xì)胞活力測(cè)定 取第3代BMSCs，以細(xì)胞濃度為6×107／L，每孔接種100μl于96孔板中的SF／CS／n－HA支架作為實(shí)驗(yàn)組，以不放支架材料為對(duì)照組，細(xì)胞箱中培養(yǎng)，分別于1、3、5、7d隨機(jī)取一孔板，MTT法測(cè)定各孔吸光值。

2.5 細(xì)胞黏附率測(cè)定 取第3代BMSCs，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107／L，每孔100μl接種在48孔板中的SF／CS／n－HA支架作為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組為不放支架材料，于細(xì)胞箱中培養(yǎng)，分別于1、3、5h細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)未附著細(xì)胞。細(xì)胞黏附率＝（接種細(xì)胞數(shù)－未附著細(xì)胞數(shù)）／接種細(xì)胞數(shù)×100%

2.6 細(xì)胞在支架上生長情況觀察：每天倒置顯微鏡下觀察支架周邊細(xì)胞生長情況，支架與細(xì)胞共培養(yǎng)7天取出支架用2.5%戊二醛固定2小時(shí)，梯度酒精脫水，干燥，噴金，掃描電鏡觀察細(xì)胞生長。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所得數(shù)據(jù)用表示。兩者間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 支架體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 分別測(cè)得個(gè)濃度組吸光值及陰性對(duì)照組吸光值，計(jì)算出RGR，通過與材料毒性等級(jí)（CTG）對(duì)比得出支架材料對(duì)BMSCs無細(xì)胞毒性，見表1、2。

表1 SF／CS／n－HA支架各濃度組浸提液與BMSCs培養(yǎng)的RGR和CTG（n＝8）Table 1 Various concentrations of SF／CS／n－HA scaffolds extract and BMSCs cultured RGR and CTG

表2 細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Classification standard of cell toxicity

3.2 細(xì)胞增殖活力測(cè)定結(jié)果 隨著時(shí)間的增長，細(xì)胞在支架上的數(shù)量明顯增加，生長良好，支架材料實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在第1、3、5、7d兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），說明支架實(shí)驗(yàn)組隨著時(shí)間增長細(xì)胞增殖活力優(yōu)于不放支架材料的對(duì)照組，見表3。

表3 不同時(shí)間SF／CS／n－HA支架對(duì)細(xì)胞增殖活力OD值（，n＝4）Table 3 SF／CS／n－HA scaffolds on cell proliferation activity at different time

表3 不同時(shí)間SF／CS／n－HA支架對(duì)細(xì)胞增殖活力OD值（，n＝4）Table 3 SF／CS／n－HA scaffolds on cell proliferation activity at different time

注：①P＜0.05，VS對(duì)照組

組數(shù) 時(shí)間（d）1 3 5 7實(shí)驗(yàn)組 0.108±0.019①0.250±0.015①0.406±0.022①0.858±0.066①對(duì)照組 0.068±0.0020.162±0.0080.307±0.0480.612±0.011

3.3 細(xì)胞黏附結(jié)果 隨著時(shí)間增加實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞黏附率均增大，兩組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），結(jié)果見表4。

3.4 BMSCs原代及傳代培養(yǎng)形態(tài) 原代BMSCs接種24小時(shí)后開始出現(xiàn)梭形細(xì)胞，經(jīng)半換液全換液除去未貼壁細(xì)胞，約72小時(shí)細(xì)胞開始增殖，生長良好，BMSCs成纖維狀、長梭形。約7天時(shí)細(xì)胞生長回合達(dá)80%～90%。傳代后細(xì)胞形態(tài)基本一致，細(xì)胞以梭形為主，增殖正常，6～8d時(shí)細(xì)胞可鋪滿瓶底，見圖1。

表4 SF／CS／n－HA支架細(xì)胞黏附率［×10－2（，n＝6）］Table 4 SF／CS／n－HA scaffolds on cell adhesion rate

表4 SF／CS／n－HA支架細(xì)胞黏附率［×10－2（，n＝6）］Table 4 SF／CS／n－HA scaffolds on cell adhesion rate

1 3 5支架材料組黏附率組別 時(shí)間（h）77.500±0.06987.500±0.05289.167±0.038對(duì)照組黏附率75.833±0.07485.000±0.05586.667±0.052

圖1 第三代BMSCs培養(yǎng)第7天（×100）Figure 1 The third generation of BMSCs at 7th day（×100）

3.5 細(xì)胞在支架上生長觀察 倒置顯微鏡觀察支架周邊細(xì)胞生長良好，增殖正常，見圖2。掃描電鏡觀察見細(xì)胞在支架材料上伸出偽足緊密黏附在支架孔隙表面。細(xì)胞為橢圓形、圓形或多角形，生長良好，分裂正常，見圖3。

圖2 SF／CS／n－HA支架復(fù)合BMSCs共培養(yǎng)7d（×100）Figure 2 SF／CS／n－HA scaffolds and BMSCs cultured at 7th d（×100）

4 討論

骨缺損修復(fù)是骨科的重要研究課題之一。當(dāng)前治療骨缺損主要采用自體或異體骨移植，但都存在一定的弊端［11］。隨著骨組織工程的發(fā)展，為骨缺損治療帶來了新的思路。支架材料、種子細(xì)胞、細(xì)胞因子是骨組織工程的研究熱點(diǎn)［12］。一種理想的支架首先必須與種子細(xì)胞具有良好的生物相容性［13］。

圖3 SF／CS／n－HA支架復(fù)合BMSCs共培養(yǎng)7dSEM（×2000）Figure 3 SF／CS／n－HA scaffolds and BMSCs cultured at 7th d（×2000）

目前材料的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)主要首選體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)，通過MTT法檢測(cè)種子細(xì)胞與支架材料共培養(yǎng)的相對(duì)增值率［14］。MTT法具有快速、重復(fù)性好、檢測(cè)結(jié)果靈敏等特點(diǎn)而廣泛用于生物材料的細(xì)胞毒性檢測(cè)［15］。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞中具有豐富的琥珀酸脫氫酶，能將MTT還原成不容于水的藍(lán)紫色結(jié)晶物質(zhì)，而該結(jié)晶物質(zhì)能溶解于DMSO，通過酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定其吸光值來間接反映細(xì)胞存活量［16］。死細(xì)胞中無琥珀酸脫氫酶，不具備此功能。本實(shí)驗(yàn)采用的支架材料為實(shí)驗(yàn)組前期研究中制備的絲素蛋白／殼聚糖／納米羥基磷灰石復(fù)合支架，通過檢測(cè)具有符合骨組織工程支架材料的孔徑、孔隙率等要求［6］。顯示支架材料與組織來源不同的種子細(xì)胞具有不同的相容性［17］。因此，采用此材料與實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊恢碌姆N子細(xì)胞BMSCs體外共培養(yǎng)來評(píng)價(jià)支架材料的生物相容性，這樣所得結(jié)果才更加準(zhǔn)確和客觀。

RGR進(jìn)行細(xì)胞毒性分級(jí)評(píng)價(jià)是國內(nèi)外學(xué)者廣泛采用的方法［18］。理想的組織工程支架材料除了要求對(duì)種子細(xì)胞無毒性作用外，還應(yīng)能促進(jìn)種子細(xì)胞的黏附增殖［19］。

5 結(jié)論

BMSCs在CS／SF／n－HA復(fù)合支架上具有良好的黏附作用。隨著時(shí)間的增加能明顯促進(jìn)BMSCs增殖，進(jìn)一步表明此支架具有良好細(xì)胞相容性，是一種理想的骨組織工程支架。但該支架在體內(nèi)的組織相容性、生物降解性、免疫源性及修復(fù)骨缺損的療效需進(jìn)一步研究。

［1］Panetta N J，Gupta D M，Longaker M T.Bone tissue engineer－ing scaffolds of today and tomorrow ［J］.J Craniofac Surg，2009，20（5）：1531－1532.

［2］Mcbane J E，Sharifpoor S，Cai K，et al.Biodegradation and in vivo biocompatibility of a degradable，polar／hydrophobic／ionic polyurethane for tissue engineering applications［J］.Biomaterials，2011，32（26）：6034－6044.

［3］Vepari C，Kaplan D L.Silk as a Biomaterial［J］.Prog Polym Sci，2007，32（8－9）：991－1007.

［4］王宇明，劉志輝，程鳳梅，等.納米羥基磷灰石的制備及表征［J］.化工科技，2010，（06）：13－16.

［5］鄧 江，佘榮峰，黃文良，等.絲素蛋白／殼聚糖三維支架與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)［J］.中國組織工程研究，2012，16（25）：4677－4681.

［6］葉 鵬，田仁元，黃文良，等.絲素蛋白／殼聚糖／納米羥基磷灰石構(gòu)建的骨組織工程支架［J］.中國組織工程研究，2013，17（29）：5269－5274.

［7］Yoshikawa T.Bone regeneration by cultured bone graft：tissue engineering using cultured marrow cells ［J］.Tanpakushitsu Kakusan Koso，2000，45（13Suppl）：2289－2296.

［8］中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部.關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指導(dǎo)性意見［J］.2006－09－30.

［9］INTERNATIONAL STANDARD ISO10993.5－1999，Biological evaluation of medical devices－Part 5.Tests for in vitro cytotoxicity.

［10］中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB／T16886.5－2003醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)，第5部，分體外細(xì)胞毒性試驗(yàn).

［11］Silva A M，Souza W M，Koivisto M B，et al.Miniplate fixation for the repair of segmental mandibular defects filled with autogenous bone in cats［J］.Acta Cir Bras，2011，26（3）：174－180.

［12］田志逢，秦書儉.骨組織工程中種子細(xì)胞與細(xì)胞支架復(fù)合培養(yǎng)的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2007，13（24）：1931－1933.

［13］李吉鵬，鄧國英，趙慶華.種子細(xì)胞－支架復(fù)合體在骨組織修復(fù)中的研究進(jìn)展［J］.中國矯形外科雜志，2012，20（20）：1857－1860.

［14］張燕搏，姜 明，王 強(qiáng)，等.組織工程血管材料體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華實(shí)用診斷與治療雜志，2011，25（06）：539－542.

［15］Qi R，Shen M，Cao X，et al.Exploring the dark side of MTT viability assay of cells cultured onto electrospun PLGA－based composite nanofibrous scaffolding materials［J］.Analyst，2011，136（14）：2897－2903.

［16］張文元，楊亞冬，房國堅(jiān).殼聚糖－絲素支架材料的細(xì)胞毒性檢測(cè)［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2010，20（10）：2395－2397.

［17］Cheung H S，Haak M H.Growth of osteoblasts on porous calcium phosphate ceramic：an in vitro model for biocompatibility study［J］.Biomaterials，1989，10（1）：63－67.

［18］Sha J M，Tao Y Q，Yan Z Y，et al.Cytotoxicity evaluation of hydroxyapatite on human umbilical cord vein endothelial cells for mechanical heart valve prosthesis applications［J］.Thorac Cardiovasc Surg，2009，57（2）：74－78.

［19］Kim B S，Mooney D J.Development of biocompatible synthetic extracellular matrices for tissue engineering ［J］.Trends Biotechnol，1998，16（5）：224－230.