沈玉平 張祖姣

（湖南科技學(xué)院 生命科學(xué)與化學(xué)工程系，湖南 永州 425199）

葡萄糖酸鹽主要用于人體微量元素補(bǔ)充[1]和建筑添加劑，在食品、建筑行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用。

葡萄糖酸鹽主要通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)。我國(guó)大部分地區(qū)夏季溫度高、時(shí)間跨度長(zhǎng)。因此，夏季生產(chǎn)必然導(dǎo)致能卻能耗的增加。此外，在葡萄糖酸發(fā)酵過程中，采用高濃度葡萄糖發(fā)酵，葡萄糖的分解產(chǎn)生高濃度的葡萄糖分解代謝物如葡萄糖酸、丙酮酸等阻遏物，阻遏葡萄糖氧化酶的合成[2]，延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間。因此，選育具有耐高溫、高糖性狀的葡糖糖酸鹽生產(chǎn)菌株具有重要的意義。

基因組改組（GS, Genome Shuffling）技術(shù)是分子定向進(jìn)化在全基因組水平上的延伸，它以整個(gè)基因組為操作對(duì)象，模擬生物進(jìn)化過程，將具有不同正突變的多個(gè)全基因組進(jìn)行隨機(jī)重組，從而快速選育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株或目的性狀得到較大改進(jìn)的菌株。Zhang Ying-Xing[3]等通過基因組改組快速提高了弗氏鏈霉菌生產(chǎn)泰樂星的能力。Ranjan Patnaik[4]等通過基因組改組提高了乳酸菌的耐酸能力，大大提高了乳酸的合成能力。Genome Shuffling技術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)就是可以在基因型和表型的相關(guān)機(jī)制不是很清楚的情況下可以迅速將決定某一理想表型的多個(gè)甚至十幾個(gè)突變基因組合在一起從而達(dá)到改進(jìn)的目的。因此，對(duì)于提高微生物的環(huán)境耐受性等基因編碼機(jī)制尚不清楚的性狀，Genome Shuffling技術(shù)有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本文在理化誘變的基礎(chǔ)上，利用Genome Shuffling技術(shù)選育耐高溫和高初始葡萄糖糖性能優(yōu)良的改組菌株，并通過搖瓶實(shí)驗(yàn)5 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其耐受高溫和初始葡萄糖糖性能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

黑曲霉ZBY-7(Aspergillus.niger ZBY-7)[5]，本實(shí)驗(yàn)室保存。菌種保藏于4 ℃的斜面培養(yǎng)基中，每?jī)蓚€(gè)月轉(zhuǎn)種一次。

1.1.2 試劑

蝸牛酶、 纖維素酶、溶菌酶購(gòu)于上海勵(lì)瑞生物科技有限公司；亞硝基胍（NTG）為FLUKA公司產(chǎn)品，其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖 300 g、KH2PO40.15 g、KCl 0.2 g、MgSO4.7H2O 0.12 g 、(NH4)2HPO40.6 g、瓊脂 20 g，蒸餾水1000mL，自然pH。

初篩培養(yǎng)基：參閱文獻(xiàn)[6]。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 300 g、MgSO4.7H2O 0.15 g 、KH2PO40.35 g、CaCO335 g、尿素 0.55 g，蒸餾水1000 mL，自然pH。

原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基[6,7]：初篩培養(yǎng)基中加入 0.6M 的MgSO4滲透壓穩(wěn)定劑即可。

1.2 方法

1.2.1 亞硝基胍-紫外誘變

挑取新鮮斜面上孢子將濃度調(diào)整到 1×106個(gè)/ml，制成孢子懸液。準(zhǔn)確稱取5mg 亞硝基胍加入到6 cm無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用1滴丙酮助溶，加入5 ml孢子懸液，在功率為15 W，距離為30 cm的紫外燈下分別照射0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 min，在紅光下取處理后的孢子懸液0.1ml涂布于平板上，培養(yǎng)后菌落計(jì)數(shù)，繪制致死曲線。

1.2.2 正突變基因庫(kù)的獲得

出發(fā)菌株經(jīng)亞硝基胍-紫外誘變，37 ℃、30 % 初始葡萄糖濃度條件下耗糖速率大于出發(fā)菌株30 ℃、10 % 初始糖濃度條件下耗糖速率的突變株為正突變株。

1.2.3 基因組改組

1.2.3.1 原生質(zhì)體的制備 參閱文獻(xiàn)[7]。

1.2.3.2 原生質(zhì)體的滅活 將原生質(zhì)體于 50 ℃水浴處理1、2、3、4、5 min，計(jì)算原生質(zhì)體的致死率。

1.2.2.3 基因組改組 將各正突變株原生質(zhì)體按1：1比例混合，在25 %聚乙二醇（PEG）6000、0.01 mol/L CaCl2溶液促融下對(duì)個(gè)正突變株的整個(gè)基因組進(jìn)行隨機(jī)重組，并通過定向篩選技術(shù)篩選出耐受高溫、高初始葡萄糖性狀得到提高的改組菌株。

1.2.4 篩選方法

1.2.4.1 初篩 根據(jù)初篩平板上透明圈的大小進(jìn)行初篩。

1.2.4.2 復(fù)篩 黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)的葡萄糖酸導(dǎo)致發(fā)酵液pH，從而抑制菌株繼續(xù)產(chǎn)酸，因此搖瓶發(fā)酵時(shí)采用 CaCO3中和產(chǎn)生的葡萄糖酸，以達(dá)到調(diào)節(jié)pH的目的。葡萄糖酸鈣的溶解度很低（40 g.L-1），未溶解的葡萄糖酸鈣以晶體的形式吸附在菌體上。因此，檢測(cè)發(fā)酵液中的葡萄糖酸鈣的含量不能真實(shí)的反應(yīng)發(fā)酵所產(chǎn)生的葡萄糖酸。劉建忠[8]經(jīng)多年研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉 ZBY-7發(fā)酵消耗的葡萄糖幾乎完全被用來(lái)產(chǎn)酸，葡萄糖的消耗量能夠真實(shí)的反應(yīng)菌株在發(fā)酵過程中葡萄糖酸的產(chǎn)生量。因此，本文通過檢測(cè)發(fā)酵液中殘?zhí)呛浚云咸烟堑南乃俾剩╩g.h-1.mL-1）表征菌株的產(chǎn)酸能力。

1.2.5 葡萄糖的測(cè)定

葡萄糖的測(cè)定采用氧化還原滴定法[8]。

1.2.6 5 L發(fā)酵罐水平實(shí)驗(yàn)

在搖瓶實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在5 L發(fā)酵罐水平上考察高濃度初始糖、高溫條件下改組菌株發(fā)酵狀況。發(fā)酵條件為pH 6.0，溫度37℃，初始葡萄糖濃度為30%，轉(zhuǎn)速 950 rpm 通氣量前2 h 為2 vvm，以后均為8 vvm，采用40% NaOH作為 pH調(diào)節(jié)劑，依據(jù)流加NaOH的體積計(jì)算發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硝基胍-紫外線誘變

通過紫外線、亞硝基胍處理，其處理時(shí)間和致死率關(guān)系如圖1。

研究表明，致死率85%左右比較容易獲得正突變株，因此我們選擇3.0 min的處理時(shí)間。

圖1.亞硝基胍-紫外線誘變會(huì)致死曲線

2.2 正突變基因庫(kù)的獲得

本文通過經(jīng)典的亞硝基胍-紫外線誘變獲取基因組改組所需的正突變基因組庫(kù)。以黑曲霉 ZBY-7為出發(fā)菌株度，亞硝基胍、紫外線處理3 min，獲得正突變株9株，其耗糖速率如表1。

表1 突變株耗糖速率

從表1我們可以看出，在初始葡萄糖濃度提高到30 %，發(fā)酵溫度提高到37 ℃情況下，突變耗糖速率較出發(fā)菌株有較大幅度的提高，其中最高的一株 A.niger-NU-3 較出發(fā)菌株提高12.48 %。這證明，通過誘變，各正突變株初步具有了耐高溫高糖的性能。

2.3 原生質(zhì)體滅活

原生質(zhì)體分別處理 1、2、3、4、5min，其致死情況見圖2。

圖2.黑曲霉原生質(zhì)體滅活致死曲線

從圖2我們可以看出，熱滅活能夠完全滅活黑曲霉原生質(zhì)體。因此，為排除基因組改組過程中親本的干擾，我們采用的50 ℃,水浴5 min的滅活方式進(jìn)行親本滅活。

2.4 基因組改組

以亞硝基胍-紫外線誘變所獲得的 9株正突變株為出發(fā)菌株進(jìn)行基因組改組，獲得8株正融合株，結(jié)果如表2所示。其中耗糖速率最高的一株為 3.00mg.h-1.mL-1，命名為A.niger-GS-30，其耗糖速率較出發(fā)菌株提高28.21%。

表2融合子的耗糖速率

A.niger-GS-30 3.00 A.niger-GS-34 2.98 A.niger-GS-42 2.93 A.niger-GS-58 2.94 A.niger-GS-62 2.96

在此次基因組改組中，菌株的耗糖速率未得大幅度提高，這可能是菌株的耗糖能力已接近極限，很難再提高；也有可能是由于遺傳背景差異較小造成的，在今后的改組中，可以采用不同的誘變劑誘變獲得遺傳背景差異較大的菌株，可能會(huì)取得更好的效果。

2.5 5 L發(fā)酵罐水平發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證耐高糖高溫菌株A.niger-GS-30在發(fā)酵罐水平上是否具有可信性和可重復(fù)性，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了5L發(fā)酵罐的葡萄糖酸鈉的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵過程中，對(duì)殘?zhí)牵≧G）和葡萄糖酸鈉的產(chǎn)量（以葡萄糖酸鈉的濃度表示，g.L-1）作了檢測(cè)，并將與出發(fā)菌株作了比較，結(jié)果如圖3。

圖3.A.niger-GS-30在 5 L發(fā)酵罐水平上殘?zhí)菨舛茸兓?葡萄糖酸鈉產(chǎn)量關(guān)系圖

圖中“◆”為出發(fā)菌株殘?zhí)茿.niger-ZBY-7含量，“◇”為出發(fā)菌株 A.niger-ZBY-7葡萄糖酸鈉含量；“▼”為改組菌株 A.niger-GS-30殘?zhí)呛浚啊蟆睘楦慕M菌株A.niger-GS-30葡萄糖酸鈉含量。

從圖3中我們可以看出，在高初始糖濃度高溫條件下，隨著葡萄糖濃度的下降，葡萄糖酸鈉濃度持續(xù)升高。A.niger-GS-30發(fā)酵2小時(shí)時(shí)已經(jīng)流加開始NaOH，說明菌體已經(jīng)開始產(chǎn)酸，而出發(fā)菌株直到發(fā)酵 4小時(shí)后才開始流加NaOH。比起出發(fā)菌株，A.niger-GS-30的適應(yīng)期縮短2h。發(fā)酵時(shí)間上，在同為30%的初始糖濃度下，出發(fā)菌株的發(fā)酵時(shí)間為36h，而A.niger-GS-30的發(fā)酵時(shí)間為33h，發(fā)酵時(shí)間縮短3h。

從發(fā)酵的效果看，A.niger-GS-30產(chǎn)率為40.82 g.h-1，比出發(fā)菌株37.12 g.h-1的產(chǎn)率提高9.97 %；A.niger-GS-30的轉(zhuǎn)化率與出發(fā)菌株相當(dāng)，分別為113.03%和111.96%。無(wú)論是發(fā)酵的產(chǎn)率還是轉(zhuǎn)化率，A.niger-GS-30都比出發(fā)菌株有一定的提高。

3 結(jié)論

3.1 通過亞硝基胍-紫外線復(fù)合誘變，初步獲得具有耐受高溫高糖性能的突變株，作為正突變株基因庫(kù)。

3.2 熱滅活5 min 可完全滅活黑曲霉原生質(zhì)體，可有效的排除基因組改組后改組菌株篩選的干擾。

3.3 通過基因組改組，獲得一株能耐受37 ℃高溫，30 %初始葡萄糖的改組菌株，其耗糖速率較出發(fā)菌株提高28.2 %，發(fā)酵溫度提高7 ℃，初始葡萄糖耐受濃度由10 %提高到30 %。

4 討論

本文通過基因組改組成功獲得一株耐高溫高糖的葡萄糖酸鹽生產(chǎn)菌，無(wú)論耗糖速率還是發(fā)酵溫度及初始糖耐受濃度均得到較大提高。這說明，在現(xiàn)今環(huán)境耐受性能的機(jī)制及基因編碼控制尚未完全弄清楚的情況下，使用 Genome shuffling技術(shù)提高菌株的環(huán)境耐受性仍不失為一種快速便捷的方法。但是，如果不采用多元化來(lái)源的正突變基因庫(kù)，其性能提高幅度將大大降低。在本文中，基因組改組的出發(fā)菌株均為亞硝基胍-紫外線復(fù)合誘變后的正突變株，其遺傳背景差異較小，因此，本次改組雖然耐高溫高糖的性能得到較大提高，但葡萄糖的耗糖速率卻提高有限。此外，如果不采用合理的方法定向篩選改組菌株，也將大大增加篩選的工作量。在本文中，采用熱滅活的方法排除親本的干擾，并通過透明圈的方法進(jìn)行初篩，這樣就大大減少了定向篩選的工作量。

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