李麗麗+郎敬+楊洪一+邰飛飛+來(lái)永才

摘要：利用PVK平板，從大豆根際土壤中分離出8株解磷菌。培養(yǎng)分析結(jié)果顯示，這8株解磷菌的溶磷圈均較大。其中，海倫Ⅲ號(hào)為革蘭氏陰性菌，其余均為革蘭氏陽(yáng)性菌。形態(tài)學(xué)觀(guān)察結(jié)果顯示，北安Ⅰ號(hào)為鏈球菌，海倫Ⅱ號(hào)、海倫Ⅲ號(hào)為球菌，海倫Ⅳ號(hào)、北安Ⅲ號(hào)為桿菌?；诩?xì)菌核糖體16S rDNA序列對(duì)北安Ⅲ號(hào)菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)合形態(tài)特征確認(rèn)該菌株為巨大芽孢桿菌，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)該菌株是一種重要的微生物資源，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為生物磷肥。

關(guān)鍵詞：解磷菌；溶磷圈；16S rDNA；大豆；生物磷肥

中圖分類(lèi)號(hào)：S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2014）08-0363-03

土壤中存在一些特定的微生物，能夠?qū)⒅参镫y以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用的形態(tài)，這些微生物被稱(chēng)為解磷菌，以細(xì)菌為主^[1]。將解磷菌作為肥料施入土壤，通過(guò)其生長(zhǎng)代謝可以在作物根際形成一個(gè)磷供應(yīng)較充分的微區(qū)，從而改善作物磷元素的供應(yīng)，增加作物磷素吸收量，提高作物產(chǎn)量，同時(shí)還可以增進(jìn)土壤肥力、增強(qiáng)植物抗病和抗旱能力^[2]。因此，解磷菌的篩選及鑒定是當(dāng)前微生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。土壤中解磷微生物種類(lèi)豐富、數(shù)量較多^[2]，目前報(bào)道的具有解磷作用的細(xì)菌有芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、固氮菌屬（Azotobacte）、根瘤菌屬（Bradxrkizobium）、硫桿菌屬（Thiobacillus）、腸細(xì)菌屬（Enterbacter）、微球菌屬（Microeoccus）、沙門(mén)氏菌屬（Salmonella）、色桿菌屬（Clromobacterium）、產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes）、節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacte）、大腸桿菌屬（Escherichia）等^[3]。解磷微生物在我國(guó)應(yīng)用較早，有較好的應(yīng)用前景，但發(fā)展不快，應(yīng)用還不普遍。篩選高效微生物肥料菌株手段單一、菌種種類(lèi)少是影響微生物肥料發(fā)展的重要因素，因而有必要對(duì)土壤中的解磷菌進(jìn)行大規(guī)模篩選，并進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，豐富菌種資源，但土壤中的細(xì)菌種類(lèi)極為豐富，通過(guò)常規(guī)的形態(tài)學(xué)和生理生化方法難以進(jìn)行有效的鑒定。筆者所在的實(shí)驗(yàn)室在前期研究中獲得了8株解磷菌，本研究對(duì)這些分離到的解磷菌進(jìn)行了形態(tài)觀(guān)察及分子鑒定，為豐富解磷微生物菌種資源打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 染色及顯微觀(guān)察

利用革蘭氏染色法^[4]對(duì)篩選到的高效解磷菌進(jìn)行染色，將菌液涂布于載玻片上，干燥，固定，結(jié)晶紫初染1 min，水洗至無(wú)色；碘液媒染1 min，水洗至無(wú)色；95%乙醇脫色30 s，水洗至無(wú)色；最后沙黃復(fù)染1 min，水洗至無(wú)色，干燥，鏡檢。

1.2 細(xì)菌總DNA的提取

接種菌株置于LB液體培養(yǎng)基中，于130 r/min下振蕩，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。取1.5 mL新鮮菌液于EP管中，于 4 000 r/min 下離心30 s，棄上清，收集菌體；加100 μg/mL 溶菌酶50 μL，于37 ℃下處理1 h輔助裂解；加入預(yù)熱的CTAB溶液500 μL，充分混合，于65 ℃水浴30 min，混勻；冷卻后，加入等體積的三氯甲烷/異戊醇（24 ∶1）抽提，顛倒充分混合，10 000 r/min離心10 min；取上清液，加入等體積三氯甲烷/異戊醇（24 ∶1），輕輕顛倒混勻，10 000 r/min離心5 min；取上清，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，沉淀30 min，8 000 r/min離心10 min；棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀2次；在超凈工作臺(tái)上風(fēng)干DNA，溶于20 μL去離子水中。

1.3 PCR擴(kuò)增

利用細(xì)菌核糖體16S rDNA通用引物27F/1492R^[5]進(jìn)行PCR反應(yīng)，其反應(yīng)體系20 μL，包括10×PCR Buffer 2.0 μL、dNTP mix 1.6 μL、25 μmol/mL引物27F/1492R各0.4 μL、Taq DNA 聚合酶 1 U、模板DNA 1 μL，去離子水補(bǔ)足至 20 μL。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，52 ℃30 s，72 ℃ 1.5 min，30 次循環(huán)；72 ℃ 7 min；4 ℃保溫。

1.4 回收及測(cè)序

利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，將純化產(chǎn)物送至大連寶生物公司進(jìn)行測(cè)序。利用BLAST工具在GenBank中對(duì)獲得的序列進(jìn)行分析^[6]。經(jīng)過(guò)NCBI比對(duì)后下載相關(guān)菌株的細(xì)菌核糖體16S rDNA序列，所得序列用Clustal X 1.81程序進(jìn)行多序列比對(duì)，并經(jīng)手工校正；然后用軟件MEGA 3.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

利用PVK平板，從大豆根際土壤中篩選出8株解磷菌，并將這8株解磷菌接種在固體LB培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)條件下菌株的溶磷圈均較大，菌落邊緣呈規(guī)則的圓形，表面光滑，中心突起，分別編號(hào)為北安Ⅰ、北安Ⅱ、北安Ⅲ、北安Ⅳ、海倫Ⅰ、海倫Ⅱ、海倫Ⅲ、海倫Ⅳ（部分菌株菌落形態(tài)見(jiàn)圖1至圖4）。由于培養(yǎng)基中加入了溴酚藍(lán)，菌落吸附了染料呈藍(lán)色，但一些菌株具有降解溴酚藍(lán)的能力，如菌株海倫Ⅱ號(hào)（圖4），藍(lán)色較淡。

革蘭氏染色結(jié)果顯示，海倫Ⅲ號(hào)為革蘭氏陰性菌，其余均為革蘭氏陽(yáng)性菌。在光學(xué)顯微鏡下可有效觀(guān)察到菌株的形態(tài)（部分菌株形態(tài)見(jiàn)圖5至圖10），其中北安Ⅰ號(hào)為鏈球菌，海倫Ⅱ號(hào)、海倫Ⅲ號(hào)為球菌，海倫Ⅳ號(hào)、北安Ⅲ號(hào)為桿菌。

3 結(jié)論

利用PVK平板對(duì)解磷菌進(jìn)行分離是一種簡(jiǎn)單有效的手段^[7]，一些菌株（如芽孢桿菌屬）在其生長(zhǎng)過(guò)程中可產(chǎn)酸，將培養(yǎng)基中的磷酸鈣溶解產(chǎn)生溶磷圈，通過(guò)分析溶磷圈的大小可對(duì)微生物的溶磷能力進(jìn)行初步估測(cè)。本研究中的菌株皆產(chǎn)生了較大的溶磷圈，說(shuō)明它們可能具有較強(qiáng)的溶磷潛力。本研究獲得的解磷菌既有球菌，又有桿菌，但已有研究中分離及初步應(yīng)用的解磷菌主要是桿菌，因而本研究重點(diǎn)選擇了一種桿菌——北安Ⅲ號(hào)進(jìn)行細(xì)菌核糖體16S rDNA序列鑒定。結(jié)合形態(tài)學(xué)特點(diǎn)及細(xì)菌核糖體16S rDNA序列，確定該菌為巨大芽孢桿菌。該菌是土壤中的重要菌群，對(duì)農(nóng)作物無(wú)害，且可能具有一些有益生物學(xué)作用，因而該菌株是一種重要的微生物資源，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為生物磷肥。

參考文獻(xiàn)：

[1]李曉婷. 解磷細(xì)菌K3的GFP標(biāo)記與在土壤中定殖及對(duì)玉米生長(zhǎng)效應(yīng)研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009：1-5.

[2]Gyaneshwar P，Naresh K G，Parekh L J，et al. Role of soil microorganisms in improving P nutrition of plants[J]. Plant and Soil，2002，245：83-93.

[3]Rodríguez H，F(xiàn)raga R. Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion[J]. Biotechnology Advances，1999，17：319-339.

[4]萬(wàn)翠番，章昭琳，王報(bào)貴，等. 高黏附力雙歧桿菌的篩選與鑒定[J]. 中國(guó)乳品工業(yè)，2012（5）：13-15.

[5]Moreno C，Romero J，Romilio T E. Polymorphism in repeated 16S rRNA genes is a common property of type strains and environmental isolates of the genus Vibrio[J]. Microbiology，2002，148：1233-1239.

[6]Altschul S F，Madden TL，Chffer A A，et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs[J]. Nucleic Acids Res，1997，25（17）：3389-3402.

[7]Kucey R M N，Janzen H H，Legett M E. Microbially mediated increases in plant available phosphorus[J]. Advances in Agronomy，1989，42：199-228.endprint

摘要：利用PVK平板，從大豆根際土壤中分離出8株解磷菌。培養(yǎng)分析結(jié)果顯示，這8株解磷菌的溶磷圈均較大。其中，海倫Ⅲ號(hào)為革蘭氏陰性菌，其余均為革蘭氏陽(yáng)性菌。形態(tài)學(xué)觀(guān)察結(jié)果顯示，北安Ⅰ號(hào)為鏈球菌，海倫Ⅱ號(hào)、海倫Ⅲ號(hào)為球菌，海倫Ⅳ號(hào)、北安Ⅲ號(hào)為桿菌?；诩?xì)菌核糖體16S rDNA序列對(duì)北安Ⅲ號(hào)菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)合形態(tài)特征確認(rèn)該菌株為巨大芽孢桿菌，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)該菌株是一種重要的微生物資源，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為生物磷肥。

關(guān)鍵詞：解磷菌；溶磷圈；16S rDNA；大豆；生物磷肥

中圖分類(lèi)號(hào)：S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2014）08-0363-03

土壤中存在一些特定的微生物，能夠?qū)⒅参镫y以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用的形態(tài)，這些微生物被稱(chēng)為解磷菌，以細(xì)菌為主^[1]。將解磷菌作為肥料施入土壤，通過(guò)其生長(zhǎng)代謝可以在作物根際形成一個(gè)磷供應(yīng)較充分的微區(qū)，從而改善作物磷元素的供應(yīng)，增加作物磷素吸收量，提高作物產(chǎn)量，同時(shí)還可以增進(jìn)土壤肥力、增強(qiáng)植物抗病和抗旱能力^[2]。因此，解磷菌的篩選及鑒定是當(dāng)前微生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。土壤中解磷微生物種類(lèi)豐富、數(shù)量較多^[2]，目前報(bào)道的具有解磷作用的細(xì)菌有芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、固氮菌屬（Azotobacte）、根瘤菌屬（Bradxrkizobium）、硫桿菌屬（Thiobacillus）、腸細(xì)菌屬（Enterbacter）、微球菌屬（Microeoccus）、沙門(mén)氏菌屬（Salmonella）、色桿菌屬（Clromobacterium）、產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes）、節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacte）、大腸桿菌屬（Escherichia）等^[3]。解磷微生物在我國(guó)應(yīng)用較早，有較好的應(yīng)用前景，但發(fā)展不快，應(yīng)用還不普遍。篩選高效微生物肥料菌株手段單一、菌種種類(lèi)少是影響微生物肥料發(fā)展的重要因素，因而有必要對(duì)土壤中的解磷菌進(jìn)行大規(guī)模篩選，并進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，豐富菌種資源，但土壤中的細(xì)菌種類(lèi)極為豐富，通過(guò)常規(guī)的形態(tài)學(xué)和生理生化方法難以進(jìn)行有效的鑒定。筆者所在的實(shí)驗(yàn)室在前期研究中獲得了8株解磷菌，本研究對(duì)這些分離到的解磷菌進(jìn)行了形態(tài)觀(guān)察及分子鑒定，為豐富解磷微生物菌種資源打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 染色及顯微觀(guān)察

利用革蘭氏染色法^[4]對(duì)篩選到的高效解磷菌進(jìn)行染色，將菌液涂布于載玻片上，干燥，固定，結(jié)晶紫初染1 min，水洗至無(wú)色；碘液媒染1 min，水洗至無(wú)色；95%乙醇脫色30 s，水洗至無(wú)色；最后沙黃復(fù)染1 min，水洗至無(wú)色，干燥，鏡檢。

1.2 細(xì)菌總DNA的提取

接種菌株置于LB液體培養(yǎng)基中，于130 r/min下振蕩，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。取1.5 mL新鮮菌液于EP管中，于 4 000 r/min 下離心30 s，棄上清，收集菌體；加100 μg/mL 溶菌酶50 μL，于37 ℃下處理1 h輔助裂解；加入預(yù)熱的CTAB溶液500 μL，充分混合，于65 ℃水浴30 min，混勻；冷卻后，加入等體積的三氯甲烷/異戊醇（24 ∶1）抽提，顛倒充分混合，10 000 r/min離心10 min；取上清液，加入等體積三氯甲烷/異戊醇（24 ∶1），輕輕顛倒混勻，10 000 r/min離心5 min；取上清，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，沉淀30 min，8 000 r/min離心10 min；棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀2次；在超凈工作臺(tái)上風(fēng)干DNA，溶于20 μL去離子水中。

1.3 PCR擴(kuò)增

利用細(xì)菌核糖體16S rDNA通用引物27F/1492R^[5]進(jìn)行PCR反應(yīng)，其反應(yīng)體系20 μL，包括10×PCR Buffer 2.0 μL、dNTP mix 1.6 μL、25 μmol/mL引物27F/1492R各0.4 μL、Taq DNA 聚合酶 1 U、模板DNA 1 μL，去離子水補(bǔ)足至 20 μL。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，52 ℃30 s，72 ℃ 1.5 min，30 次循環(huán)；72 ℃ 7 min；4 ℃保溫。

1.4 回收及測(cè)序

利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，將純化產(chǎn)物送至大連寶生物公司進(jìn)行測(cè)序。利用BLAST工具在GenBank中對(duì)獲得的序列進(jìn)行分析^[6]。經(jīng)過(guò)NCBI比對(duì)后下載相關(guān)菌株的細(xì)菌核糖體16S rDNA序列，所得序列用Clustal X 1.81程序進(jìn)行多序列比對(duì)，并經(jīng)手工校正；然后用軟件MEGA 3.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

利用PVK平板，從大豆根際土壤中篩選出8株解磷菌，并將這8株解磷菌接種在固體LB培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)條件下菌株的溶磷圈均較大，菌落邊緣呈規(guī)則的圓形，表面光滑，中心突起，分別編號(hào)為北安Ⅰ、北安Ⅱ、北安Ⅲ、北安Ⅳ、海倫Ⅰ、海倫Ⅱ、海倫Ⅲ、海倫Ⅳ（部分菌株菌落形態(tài)見(jiàn)圖1至圖4）。由于培養(yǎng)基中加入了溴酚藍(lán)，菌落吸附了染料呈藍(lán)色，但一些菌株具有降解溴酚藍(lán)的能力，如菌株海倫Ⅱ號(hào)（圖4），藍(lán)色較淡。

革蘭氏染色結(jié)果顯示，海倫Ⅲ號(hào)為革蘭氏陰性菌，其余均為革蘭氏陽(yáng)性菌。在光學(xué)顯微鏡下可有效觀(guān)察到菌株的形態(tài)（部分菌株形態(tài)見(jiàn)圖5至圖10），其中北安Ⅰ號(hào)為鏈球菌，海倫Ⅱ號(hào)、海倫Ⅲ號(hào)為球菌，海倫Ⅳ號(hào)、北安Ⅲ號(hào)為桿菌。

3 結(jié)論

利用PVK平板對(duì)解磷菌進(jìn)行分離是一種簡(jiǎn)單有效的手段^[7]，一些菌株（如芽孢桿菌屬）在其生長(zhǎng)過(guò)程中可產(chǎn)酸，將培養(yǎng)基中的磷酸鈣溶解產(chǎn)生溶磷圈，通過(guò)分析溶磷圈的大小可對(duì)微生物的溶磷能力進(jìn)行初步估測(cè)。本研究中的菌株皆產(chǎn)生了較大的溶磷圈，說(shuō)明它們可能具有較強(qiáng)的溶磷潛力。本研究獲得的解磷菌既有球菌，又有桿菌，但已有研究中分離及初步應(yīng)用的解磷菌主要是桿菌，因而本研究重點(diǎn)選擇了一種桿菌——北安Ⅲ號(hào)進(jìn)行細(xì)菌核糖體16S rDNA序列鑒定。結(jié)合形態(tài)學(xué)特點(diǎn)及細(xì)菌核糖體16S rDNA序列，確定該菌為巨大芽孢桿菌。該菌是土壤中的重要菌群，對(duì)農(nóng)作物無(wú)害，且可能具有一些有益生物學(xué)作用，因而該菌株是一種重要的微生物資源，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為生物磷肥。

參考文獻(xiàn)：

[1]李曉婷. 解磷細(xì)菌K3的GFP標(biāo)記與在土壤中定殖及對(duì)玉米生長(zhǎng)效應(yīng)研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009：1-5.

[2]Gyaneshwar P，Naresh K G，Parekh L J，et al. Role of soil microorganisms in improving P nutrition of plants[J]. Plant and Soil，2002，245：83-93.

[3]Rodríguez H，F(xiàn)raga R. Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion[J]. Biotechnology Advances，1999，17：319-339.

[4]萬(wàn)翠番，章昭琳，王報(bào)貴，等. 高黏附力雙歧桿菌的篩選與鑒定[J]. 中國(guó)乳品工業(yè)，2012（5）：13-15.

[5]Moreno C，Romero J，Romilio T E. Polymorphism in repeated 16S rRNA genes is a common property of type strains and environmental isolates of the genus Vibrio[J]. Microbiology，2002，148：1233-1239.

[6]Altschul S F，Madden TL，Chffer A A，et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs[J]. Nucleic Acids Res，1997，25（17）：3389-3402.

[7]Kucey R M N，Janzen H H，Legett M E. Microbially mediated increases in plant available phosphorus[J]. Advances in Agronomy，1989，42：199-228.endprint

摘要：利用PVK平板，從大豆根際土壤中分離出8株解磷菌。培養(yǎng)分析結(jié)果顯示，這8株解磷菌的溶磷圈均較大。其中，海倫Ⅲ號(hào)為革蘭氏陰性菌，其余均為革蘭氏陽(yáng)性菌。形態(tài)學(xué)觀(guān)察結(jié)果顯示，北安Ⅰ號(hào)為鏈球菌，海倫Ⅱ號(hào)、海倫Ⅲ號(hào)為球菌，海倫Ⅳ號(hào)、北安Ⅲ號(hào)為桿菌?；诩?xì)菌核糖體16S rDNA序列對(duì)北安Ⅲ號(hào)菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)合形態(tài)特征確認(rèn)該菌株為巨大芽孢桿菌，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)該菌株是一種重要的微生物資源，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為生物磷肥。

關(guān)鍵詞：解磷菌；溶磷圈；16S rDNA；大豆；生物磷肥

中圖分類(lèi)號(hào)：S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2014）08-0363-03

土壤中存在一些特定的微生物，能夠?qū)⒅参镫y以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用的形態(tài)，這些微生物被稱(chēng)為解磷菌，以細(xì)菌為主^[1]。將解磷菌作為肥料施入土壤，通過(guò)其生長(zhǎng)代謝可以在作物根際形成一個(gè)磷供應(yīng)較充分的微區(qū)，從而改善作物磷元素的供應(yīng)，增加作物磷素吸收量，提高作物產(chǎn)量，同時(shí)還可以增進(jìn)土壤肥力、增強(qiáng)植物抗病和抗旱能力^[2]。因此，解磷菌的篩選及鑒定是當(dāng)前微生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。土壤中解磷微生物種類(lèi)豐富、數(shù)量較多^[2]，目前報(bào)道的具有解磷作用的細(xì)菌有芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、固氮菌屬（Azotobacte）、根瘤菌屬（Bradxrkizobium）、硫桿菌屬（Thiobacillus）、腸細(xì)菌屬（Enterbacter）、微球菌屬（Microeoccus）、沙門(mén)氏菌屬（Salmonella）、色桿菌屬（Clromobacterium）、產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes）、節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacte）、大腸桿菌屬（Escherichia）等^[3]。解磷微生物在我國(guó)應(yīng)用較早，有較好的應(yīng)用前景，但發(fā)展不快，應(yīng)用還不普遍。篩選高效微生物肥料菌株手段單一、菌種種類(lèi)少是影響微生物肥料發(fā)展的重要因素，因而有必要對(duì)土壤中的解磷菌進(jìn)行大規(guī)模篩選，并進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，豐富菌種資源，但土壤中的細(xì)菌種類(lèi)極為豐富，通過(guò)常規(guī)的形態(tài)學(xué)和生理生化方法難以進(jìn)行有效的鑒定。筆者所在的實(shí)驗(yàn)室在前期研究中獲得了8株解磷菌，本研究對(duì)這些分離到的解磷菌進(jìn)行了形態(tài)觀(guān)察及分子鑒定，為豐富解磷微生物菌種資源打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 染色及顯微觀(guān)察

利用革蘭氏染色法^[4]對(duì)篩選到的高效解磷菌進(jìn)行染色，將菌液涂布于載玻片上，干燥，固定，結(jié)晶紫初染1 min，水洗至無(wú)色；碘液媒染1 min，水洗至無(wú)色；95%乙醇脫色30 s，水洗至無(wú)色；最后沙黃復(fù)染1 min，水洗至無(wú)色，干燥，鏡檢。

1.2 細(xì)菌總DNA的提取

接種菌株置于LB液體培養(yǎng)基中，于130 r/min下振蕩，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。取1.5 mL新鮮菌液于EP管中，于 4 000 r/min 下離心30 s，棄上清，收集菌體；加100 μg/mL 溶菌酶50 μL，于37 ℃下處理1 h輔助裂解；加入預(yù)熱的CTAB溶液500 μL，充分混合，于65 ℃水浴30 min，混勻；冷卻后，加入等體積的三氯甲烷/異戊醇（24 ∶1）抽提，顛倒充分混合，10 000 r/min離心10 min；取上清液，加入等體積三氯甲烷/異戊醇（24 ∶1），輕輕顛倒混勻，10 000 r/min離心5 min；取上清，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，沉淀30 min，8 000 r/min離心10 min；棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀2次；在超凈工作臺(tái)上風(fēng)干DNA，溶于20 μL去離子水中。

1.3 PCR擴(kuò)增

利用細(xì)菌核糖體16S rDNA通用引物27F/1492R^[5]進(jìn)行PCR反應(yīng)，其反應(yīng)體系20 μL，包括10×PCR Buffer 2.0 μL、dNTP mix 1.6 μL、25 μmol/mL引物27F/1492R各0.4 μL、Taq DNA 聚合酶 1 U、模板DNA 1 μL，去離子水補(bǔ)足至 20 μL。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，52 ℃30 s，72 ℃ 1.5 min，30 次循環(huán)；72 ℃ 7 min；4 ℃保溫。

1.4 回收及測(cè)序

利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，將純化產(chǎn)物送至大連寶生物公司進(jìn)行測(cè)序。利用BLAST工具在GenBank中對(duì)獲得的序列進(jìn)行分析^[6]。經(jīng)過(guò)NCBI比對(duì)后下載相關(guān)菌株的細(xì)菌核糖體16S rDNA序列，所得序列用Clustal X 1.81程序進(jìn)行多序列比對(duì)，并經(jīng)手工校正；然后用軟件MEGA 3.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

利用PVK平板，從大豆根際土壤中篩選出8株解磷菌，并將這8株解磷菌接種在固體LB培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)條件下菌株的溶磷圈均較大，菌落邊緣呈規(guī)則的圓形，表面光滑，中心突起，分別編號(hào)為北安Ⅰ、北安Ⅱ、北安Ⅲ、北安Ⅳ、海倫Ⅰ、海倫Ⅱ、海倫Ⅲ、海倫Ⅳ（部分菌株菌落形態(tài)見(jiàn)圖1至圖4）。由于培養(yǎng)基中加入了溴酚藍(lán)，菌落吸附了染料呈藍(lán)色，但一些菌株具有降解溴酚藍(lán)的能力，如菌株海倫Ⅱ號(hào)（圖4），藍(lán)色較淡。

革蘭氏染色結(jié)果顯示，海倫Ⅲ號(hào)為革蘭氏陰性菌，其余均為革蘭氏陽(yáng)性菌。在光學(xué)顯微鏡下可有效觀(guān)察到菌株的形態(tài)（部分菌株形態(tài)見(jiàn)圖5至圖10），其中北安Ⅰ號(hào)為鏈球菌，海倫Ⅱ號(hào)、海倫Ⅲ號(hào)為球菌，海倫Ⅳ號(hào)、北安Ⅲ號(hào)為桿菌。

3 結(jié)論

利用PVK平板對(duì)解磷菌進(jìn)行分離是一種簡(jiǎn)單有效的手段^[7]，一些菌株（如芽孢桿菌屬）在其生長(zhǎng)過(guò)程中可產(chǎn)酸，將培養(yǎng)基中的磷酸鈣溶解產(chǎn)生溶磷圈，通過(guò)分析溶磷圈的大小可對(duì)微生物的溶磷能力進(jìn)行初步估測(cè)。本研究中的菌株皆產(chǎn)生了較大的溶磷圈，說(shuō)明它們可能具有較強(qiáng)的溶磷潛力。本研究獲得的解磷菌既有球菌，又有桿菌，但已有研究中分離及初步應(yīng)用的解磷菌主要是桿菌，因而本研究重點(diǎn)選擇了一種桿菌——北安Ⅲ號(hào)進(jìn)行細(xì)菌核糖體16S rDNA序列鑒定。結(jié)合形態(tài)學(xué)特點(diǎn)及細(xì)菌核糖體16S rDNA序列，確定該菌為巨大芽孢桿菌。該菌是土壤中的重要菌群，對(duì)農(nóng)作物無(wú)害，且可能具有一些有益生物學(xué)作用，因而該菌株是一種重要的微生物資源，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為生物磷肥。

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